羅躍龍，嚴(yán)瑞娟，，張水寒，蔡 萍，肖 娟，萬 丹

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院中藥新藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410013）

杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮，有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎之功效，用于治療肝腎不足、腰膝酸痛、胎動(dòng)不安等癥[1]。明·陳嘉謨《本草蒙筌》提出“入鹽走腎臟仍仗軟堅(jiān)”，故臨床上杜仲多以鹽炙品入藥，以增強(qiáng)其補(bǔ)腎健腰、強(qiáng)筋骨之功。傳統(tǒng)的炮制方法為鹽炙，標(biāo)準(zhǔn)以斷絲為宜，程度難以掌控，往往“太過”或“不及”，且勞動(dòng)強(qiáng)度大，后提出烘法炮制杜仲[2]。但以上兩種方法的具體的操作工藝參數(shù)均說法不一，造成杜仲炮制品質(zhì)量難以保證，而飲片質(zhì)量是發(fā)揮臨床療效的關(guān)鍵因素，作者未見有杜仲炮制工藝研究將切制規(guī)格橫絲、縱絲、塊結(jié)合溫度、時(shí)間進(jìn)行考察的記載，因此本文采用正交試驗(yàn)法，首次以切制規(guī)格（橫絲、縱絲、塊）、溫度、時(shí)間為考察因素，探索鹽炙和烘制的最佳工藝，以期為提高和規(guī)范杜仲飲片的質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

LC-10ATVP高效液相色譜儀（日本島津，配備SPD-M10AVP光電二極管陣列檢測(cè)器，CLASS-VP色譜工作站）；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；美的SK2103電磁爐；格蘭仕G8023YSL-V1型微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）；KQ3200型超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-12021001，純度＞98%）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3 試藥

杜仲皮于2012年6月采自貴州省遵義市楓香鎮(zhèn)，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所謝昭明研究員鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的樹皮，發(fā)汗備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 杜仲炮制工藝的設(shè)計(jì)

2.1.1 鹽炙杜仲 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[3-4]，選擇切制規(guī)格（A）、鹽炙溫度（B）、鹽炙時(shí)間（C）作為炮制工藝的考察和外觀質(zhì)量因素，以松脂醇二葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以綜合評(píng)分的方法，采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)。具體炮制方法：取杜仲皮，刮去殘留粗皮，洗凈，分別切制成0.5 cm橫絲、0.5 cm縱絲和2 cm×2 cm的塊，干燥。稱取9份，每份100 g，加食鹽水（每100 kg藥材用10 L 20%食鹽水）浸潤(rùn)，待鹽水被吸盡后，置于鐵鍋中于電磁爐上進(jìn)行鹽炙，按表1因素水平安排制備炮制樣品，平行試驗(yàn)3次。

2.1.2 烘制杜仲 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，選擇切制規(guī)格（A）、烘制溫度（B）、烘制時(shí)間（C）作為炮制工藝的考察和外觀質(zhì)量因素，以松脂醇二葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以綜合評(píng)分的方法，采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)。具體炮制方法：同“2.1.1”方法凈制、切制、加鹽水浸潤(rùn)后，取9份，每份100 g，分別平鋪于瓷托盤上，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，按表2因素水平安排制備炮制樣品，平行試驗(yàn)3次。

表1 鹽炙杜仲因素水平表

表2 烘制杜仲因素水平表

2.1.3 數(shù)據(jù)處理 為客觀地反映杜仲炮制工藝中各個(gè)因素對(duì)成品質(zhì)量的影響，本試驗(yàn)以傳統(tǒng)外觀質(zhì)量、醇溶性浸出物量及與杜仲功能主治相關(guān)的功效成分松脂醇二葡萄糖苷含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。傳統(tǒng)外觀質(zhì)量評(píng)分，色澤方面：樣品表面黑褐色為5分；表面焦黑為4分；表面淺棕色為3分，再隨顏色變淺依次逐減。斷絲程度：將樣品沿膠絲生長(zhǎng)方向拉長(zhǎng)0.1 cm斷絲者為5分；拉長(zhǎng)0.2 cm斷絲者為4分；拉長(zhǎng)0.3 cm斷絲者為3分；依次逐減。以綜合質(zhì)量評(píng)分法進(jìn)行評(píng)價(jià)，因有效成分松脂醇二葡萄糖苷含量占據(jù)重要地位，故其加權(quán)系數(shù)為0.7，醇溶性浸出物量加權(quán)系數(shù)為0.2，傳統(tǒng)外觀質(zhì)量加權(quán)系數(shù)為0.1。綜合質(zhì)量評(píng)分＝70×(松脂醇二葡萄糖苷實(shí)際量/松脂醇二葡萄糖苷最高量)＋20×(醇溶性浸出物實(shí)際量/醇溶性浸出物最高量)＋10×(傳統(tǒng)外觀質(zhì)量實(shí)際評(píng)分/傳統(tǒng)外觀質(zhì)量最高分)。

2.2 醇溶性浸出物的測(cè)定[1]

取炮制杜仲樣品適量，剪成碎片，揉成絮狀，取2 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加75%乙醇100 mL作溶劑，按《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅩA醇溶性浸出物測(cè)定法（熱浸法）測(cè)定，以干燥品計(jì)算樣品中醇溶性浸出物量。

2.3 松脂醇二葡萄糖苷含量的測(cè)定[1]

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Promosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-水(25∶75)，檢測(cè)波長(zhǎng)277 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取松脂醇二葡萄糖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為0.49 mg/mL的溶液，搖勻即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取炮制杜仲樣品適量，剪成碎片，揉成絮狀，取約5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min[5]，放冷。再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入高效液相色譜儀，測(cè)定。對(duì)照品進(jìn)樣量（Y）對(duì)其相應(yīng)色譜峰峰面積（X）的線性回歸方程為：

表明松脂醇二葡萄糖苷在0.98～9.8μg范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量的線性關(guān)系良好。

2.3.4 樣品測(cè)定 分別精密吸取各炮制杜仲樣品的供試品溶液20μL、對(duì)照品溶液20μL，分別注入高效液相色譜儀中，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品（以干燥品計(jì)）中松脂醇二葡萄糖苷的含量。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

2.4.1 試驗(yàn)結(jié)果 鹽炙和烘制杜仲工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果見表3～4。

表3 鹽炙杜仲工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 （±s，n=3）

表3 鹽炙杜仲工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 （±s，n=3）

列號(hào) A B C 空白 松脂醇二葡萄糖苷(m g/g) 醇浸出量(%) 外觀質(zhì)量(分) 綜合評(píng)分1 1 1 1 1 0.59±0.0 1 14.84±0.41 6 33.79 2 1 2 2 2 0.59±0.0 1 14.81±0.34 9 36.75 3 1 3 3 3 0.88±0.0 1 16.44±0.38 8 42.81 4 2 1 2 3 1.11±0.02 16.35±0.35 5 43.79 5 2 2 3 1 1.94±0.0 4 17.15±0.37 6 60.47 6 2 3 1 2 1.85±0.0 3 15.98±0.42 9 60.50 7 3 1 3 2 2.71±0.0 4 16.85±0.52 7 74.80 8 3 2 1 3 2.43±0.0 4 16.33±0.42 9 71.22 9 3 3 2 1 1.76±0.0 4 15.90±0.52 8 57.81 K 1 113.35 152.37 165.51 152.07 K 2 164.76 168.44 138.35 172.05 K 3 203.82 161.12 178.07 157.81 R 90.47 16.07 39.72 19.98

表4 烘制杜仲工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 （±s，n=3）

表4 烘制杜仲工藝正交試驗(yàn)結(jié)果 （±s，n=3）

列號(hào) A B C 空白 松脂醇二葡萄糖苷(m g/g) 醇浸出量(%) 外觀質(zhì)量分(分) 綜合評(píng)分1 1 1 1 1 1.19±0.0 2 15.21±0.38 9 47.88 2 1 2 2 2 0.75±0.0 1 14.22±0.30 9 38.91 3 1 3 3 3 0.52±0.0 1 12.72±0.35 9 33.07 4 2 1 2 3 1.79±0.0 3 16.67±0.46 10 61.24 5 2 2 3 1 1.51±0.0 3 15.53±0.42 7 51.94 6 2 3 1 2 1.21±0.0 2 11.18±0.26 9 43.54 7 3 1 3 2 3.94±0.0 8 16.33±0.47 9 98.04 8 3 2 1 3 0.44±0.0 1 12.17±0.25 8 30.01 9 3 3 2 1 0.07±0.0 1 12.76±0.32 8 24.12 K 1 119.86 207.17 121.42 123.94 K 2 156.72 120.86 124.27 180.49 K 3 152.18 100.73 183.05 124.32 R 36.86 106.44 61.63 56.55

2.4.2 方差分析 鹽炙杜仲及烘制杜仲的方差分析結(jié)果分別見表5～6。

表5 鹽炙杜仲工藝方差分析表

表6 烘制杜仲工藝方差分析表

鹽炙杜仲工藝以綜合質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，由極差R可知影響鹽炙杜仲質(zhì)量的主次因素依次為A＞C＞B，方差分析結(jié)果顯示，A因素有顯著性影響，而B和C因素?zé)o明顯影響；最佳鹽炙工藝方案為A3B2C3，即切制成2 cm×2 cm的塊，鹽炙溫度為180℃，鹽炙時(shí)間為10 min。

烘制杜仲工藝以綜合質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，由極差R可知影響烘制杜仲質(zhì)量的主次因素依次為B＞C＞A，方差分析結(jié)果顯示，方差分析結(jié)果顯示，A、B和C因素均無明顯影響；最佳烘制工藝方案為A2B1C3，即切制成0.5 cm的縱絲，烘制溫度為120℃，烘制時(shí)間為0.5 h。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出的鹽炙與烘制工藝最佳組合均不在正交表試驗(yàn)方案中，故需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。鹽炙：將杜仲切制成2 cm×2 cm的塊，稱取100 g置于鐵鍋中，于電磁爐上180℃鹽炙10 min，取出，晾涼即得。平行試驗(yàn)3次。烘制：將杜仲切制成0.5 cm的縱絲，稱取100 g平鋪于瓷托盤上，放入120℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，烘制0.5 h。平行試驗(yàn)3次。驗(yàn)證結(jié)果見表7。并用SPSS 16.0軟件對(duì)兩種工藝結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 （±s）

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 （±s）

試驗(yàn)組 松脂醇二葡萄糖苷(mg/g) 醇浸出量(%)鹽炙 2.78±0.04 17.13±0.05烘制 4.01±0.04 16.48±0.05

驗(yàn)證試驗(yàn)表明，二指標(biāo)數(shù)據(jù)均大于正交表9個(gè)組合中任何一組，故優(yōu)選的工藝參數(shù)合理可行，能制備出質(zhì)量穩(wěn)定的杜仲飲片。用SPSS 16.0軟件輸出的t檢驗(yàn)結(jié)果中，t統(tǒng)計(jì)量的相伴概率P均為0，小于顯著性水平0.05，證明兩種工藝的松脂醇二葡萄糖苷含量和醇浸出量平均值存在顯著性差異?？紤]到松脂醇二葡萄糖苷為杜仲的主要有效成分，故認(rèn)為烘制工藝為較佳選擇。

3 討論

前人對(duì)杜仲炮制品質(zhì)量評(píng)價(jià)方面，有的采用斷絲率或單采用醇浸出物為指標(biāo)，評(píng)價(jià)指標(biāo)單一。松脂醇二葡萄苷為杜仲的主要的降壓成分[6]，以其為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，再結(jié)合《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部中規(guī)定的醇浸出物量，更能合理地反映出炮制品的質(zhì)量。另外，在炮制工藝的考察因素上，前人還常涉及加鹽量的考察，但通過預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)研究，加鹽量對(duì)炮制質(zhì)量影響不大，反而是不同的切制規(guī)格成為炮制質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵因素，故本文將切制規(guī)格列為考察對(duì)象之一。

本研究同時(shí)優(yōu)選了鹽炙和烘制兩種方法的操作工藝，其中烘制工藝中于120℃烘制0.5 h時(shí)縱絲和塊的綜合評(píng)分均較高，鹽炙最佳工藝的切制規(guī)格亦為塊，這與歷來研究得出的杜仲以切制成橫絲為最佳的結(jié)論有所不同，可見切制規(guī)格或許也因“法”制宜。通過比較兩種炮制方法的最佳工藝，烘制品較鹽炙品綜合質(zhì)量高，且烘法有節(jié)能、回收率高、勞動(dòng)強(qiáng)度低等優(yōu)點(diǎn)，便于規(guī)?；?。后續(xù)研究將進(jìn)一步從藥理學(xué)試驗(yàn)、臨床研究等方面論證烘制杜仲的工藝效果，企業(yè)可考慮以此法替代傳統(tǒng)鹽炙法而達(dá)到低成本規(guī)范化生產(chǎn)，并提高杜仲飲片的質(zhì)量從而提高效益。

[1]中國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：154.

[2]郝武常，朱志峰，朱宇紅，等.炮制對(duì)杜仲中松脂醇二葡萄糖苷含量的影響[J].中國(guó)中藥雜志，1996，21(7)：410.

[3]李 川.不同炮制方法對(duì)杜仲總成分煎出率的影響[J].中藥材，1989，12(2)：29.

[4]高學(xué)昌，趙海東.杜仲炮制初探[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，1994，5(3)：25.

[5]馮鎖民，甘志杰，翟西峰，等.杜仲原生皮與再生皮中松脂醇二葡萄糖苷的含量比較[J].中藥材，2006，28(8)：792-794.

[6]韓宇東，李文娜.杜仲的化學(xué)成分和藥理活性及臨床應(yīng)用研究新進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(5)：3-5.