唐伯辰，梁華正，劉成佐，江旦林，2，廖曉峰

（1.東華理工大學(xué)化學(xué)生物與材料科學(xué)學(xué)院，江西 撫州344000；2.臨川之信生物科技有限公司，江西 撫州344000）

荷葉為睡蓮科植物蓮的干燥葉，傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為荷葉有清暑化濕、升發(fā)清陽、涼血止血等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，荷葉堿是荷葉的主要藥效成分之一，荷葉堿具有刺激胰島素分泌[1]、抗病毒[2]、降脂減肥[3]等作用，有關(guān)荷葉堿的分離提取及高效液相色譜分析方法的文獻(xiàn)報(bào)道較多[4-8]。撫州市廣昌縣種植白蓮有1 300多年的歷史，享有“白蓮之鄉(xiāng)”的美譽(yù)，從1994年至今，廣昌白蓮先后兩次進(jìn)行太空育種，選育后的太空蓮品種大大提高了蓮子產(chǎn)量，但對(duì)于太空蓮葉中荷葉堿含量的研究鮮見報(bào)道[9]。本文采用高效液相色譜法對(duì)不同生長期的太空蓮葉中荷葉堿的含量進(jìn)行了測(cè)定，為充分利用荷葉資源提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器

LC-20AT/SPD-10A高效液相色譜儀(日本島津)；N2000色譜數(shù)據(jù)工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)；電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；酸度計(jì)（上海雷磁）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）。

1.2 材料與試劑

荷葉（采自江西省撫州市廣昌縣）經(jīng)東華理工大學(xué)生物系饒軍教授鑒定為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥葉；乙腈（色譜純，西隴化工股份有限公司）；荷葉堿對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所）；水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 取荷葉堿對(duì)照品適量，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別配制成0.8 mg/mL的溶液備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 將新鮮荷葉用水洗凈，70℃烘干，粉碎，過40目篩，取約1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，每次加pH 2.0的90%甲醇溶液50 mL，回流提取2 h，提取兩次，濾過于100 mL容量瓶中，用pH 2.0的90%甲醇溶液洗滌、稀釋至刻度，搖勻，備用。再精密吸取25 mL，置50 mL容量瓶中，用pH 2.0的90%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2 色譜條件

色譜柱為Hypersil BDS C18柱 (4.6 mm×250 mm，5.0μm)；流動(dòng)相為乙腈-水-三乙胺-乙酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長為270 nm；進(jìn)樣量為20μL；柱溫為室溫。HPLC圖見圖1。

圖1 荷葉堿對(duì)照品(a)和供試品溶液(b)色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察

分別取0.2 mg/mL荷葉堿對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取各溶液20μL注入色譜儀，記錄荷葉堿峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：

結(jié)果表明荷葉堿對(duì)照品溶液在0.01～0.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取荷葉堿對(duì)照品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，荷葉堿峰面積的RSD為0.9%，表明精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取荷葉供試品溶液20μL，分別在0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測(cè)定荷葉堿的峰面積，結(jié)果RSD為1.2%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一采集地點(diǎn)和時(shí)間太空蓮葉樣品5份，按“2.1.2”項(xiàng)方法分別制備供試品溶液，測(cè)定峰面積并計(jì)算含量為0.455%，RSD為1.4%。

2.7 回收率試驗(yàn)

取荷葉粉末1 g，精密稱定，分高、中、低3個(gè)濃度，分別加入荷葉堿對(duì)照品溶液0.5、1、1.5 mL，按上述供試品溶液的制備方法及色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果平均回收率為98.7%，RSD=1.5%。結(jié)果見表1。

表1 荷葉堿加樣回收率測(cè)定結(jié)果表

2.8 不同采收期太空蓮葉中荷葉堿含量

按藥典要求，荷葉采收期一般為夏秋兩季，因此選取6月至10月為樣品采集期。由于采集期內(nèi)的大部分時(shí)間段，荷塘中都有多種不同生長狀態(tài)的荷葉，荷葉生長大致可分為5個(gè)階段，初生嫩葉，生長期嫩葉，近成熟葉，成熟葉，衰老葉[10]。因此在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均采集5個(gè)不同生長期的荷葉樣本，選取的采集時(shí)間點(diǎn)為6月5日、7月5日、8月5日、9月5日、10月5日，每次采集5組不同太空蓮葉，分別為：初生期嫩葉，葉子剛由葉芽展開，葉片單薄，青綠色；生長期嫩葉，葉片舒展，黃綠色，質(zhì)嫩；近成熟葉，葉子直徑已近成熟，黃綠色；成熟葉，葉片寬大，綠色，葉片厚實(shí)；衰老葉，葉子邊緣萎蔫，黃褐色[10]。依法分別測(cè)定5個(gè)采集期內(nèi)5種不同生長狀態(tài)的荷葉中荷葉堿的含量，結(jié)果見表2。

由表2可知，8月5日的初生嫩葉荷葉堿含量最高，但是由于初生嫩葉生物量太小，而成熟葉和近成熟葉生物量大，因此一般荷葉采集以成熟葉和近成熟葉為主。由表2可知，5組不同荷葉樣品，荷葉堿含量有顯著差異性，近成熟葉的荷葉堿含量普遍大于成熟葉，而8月至9月的近成熟葉荷葉堿含量相對(duì)其他時(shí)間段的近成熟葉荷葉堿含量要高，因此建議荷葉應(yīng)該在8月至9月采集近成熟葉為主。

表2 不同采集期內(nèi)不同生長狀態(tài)的太空蓮葉中荷葉堿的含量 （n=3，±s，%）

表2 不同采集期內(nèi)不同生長狀態(tài)的太空蓮葉中荷葉堿的含量 （n=3，±s，%）

注：6月與7、8、9月嫩葉比較**P＜0.01。

各期葉片初生嫩葉生長嫩葉近成熟葉成熟葉衰老葉6月5日0.235±0.003 0.305±0.005 0.356±0.007 0.201±0.004 0.106±0.006 7月5日0.331±0.004 0.372±0.005 0.391±0.008 0.322±0.005 0.125±0.007荷葉堿含量（%）8月5日0.522±0.005**0.489±0.004**0.466±0.006 0.355±0.008 0.113±0.005 9月5日0.501±0.007**0.488±0.006**0.455±0.009 0.368±0.004 0.156±0.007 10月5日未采到未采到0.436±0.008 0.388±0.007 0.185±0.006

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

采用了不同比例的甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相，荷葉堿峰分離度小且峰型拖尾嚴(yán)重，加入0.78%的冰乙酸和1.6%的三乙胺，峰型較好，分離效果較好，可滿足對(duì)樣品的檢測(cè)要求。

3.2 樣品荷葉堿提取方法的選擇

實(shí)驗(yàn)中采用了多種有機(jī)溶劑進(jìn)行提取試驗(yàn)，如甲醇、乙醇、四氫呋喃、二甲亞砜、氯仿等，相對(duì)而言甲醇提取效果較好，且毒性相對(duì)較小，因此選用甲醇作為提取溶劑。同時(shí)還考察不同酸度和固液比對(duì)提取效率的影響，結(jié)果為以甲醇為提取溶劑，固液比為1∶50，回流提取2 h，提取次數(shù)為2次，pH 2.0時(shí)，荷葉堿提取率最高。

3.3 關(guān)于荷葉藥材的質(zhì)量

按藥典要求，荷葉采收期一般為夏秋兩季，作為藥材的干荷葉，其荷葉堿含量要求大于0.1%。由于受品種、氣候、水質(zhì)、土壤環(huán)境甚至炮制工藝等因素影響，荷葉質(zhì)量參差不齊，有關(guān)研究表明，以荷葉中的荷葉堿為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果在隨機(jī)抽取的24個(gè)樣品中，僅2個(gè)樣品合格，22個(gè)樣品不合格，合格率為8.3%[11]。太空蓮近成熟葉中荷葉堿含量達(dá)到0.45%以上，高于一般荷葉的荷葉堿含量[10-11]。目前在撫州市廣昌縣，太空蓮種植集約化程度相對(duì)較高，具有較好的開展中藥材GAP種植的條件，因此太空蓮葉作為荷葉藥材資源具有較好的前景。

荷葉在上世紀(jì)90年代就被列入“既是食品又是藥品”的名單，我國具有豐富的荷葉資源，在“蓮子之鄉(xiāng)”的撫州市廣昌縣，蓮農(nóng)采摘蓮子之后，荷葉都枯萎在荷塘里自然腐爛，浪費(fèi)了資源。本文通過對(duì)太空蓮葉中荷葉堿的研究，為荷葉資源的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

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