羅亞坤　程燕

【摘 要】目的建立一種小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)的簡便方法。方法以無血清的DMEM培養(yǎng)液灌洗小鼠腹腔，分離獲取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，在含有10%成牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算存活率，瑞氏染色計(jì)算純度。結(jié)果 獲得高純度的巨噬細(xì)胞，具備巨噬細(xì)胞的形態(tài)特征。結(jié)論該方法是一種簡單可行的分離巨噬細(xì)胞的方法。

【關(guān)鍵詞】小鼠；巨噬細(xì)胞；分離；培養(yǎng)；鑒定

0.引言

巨噬細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞， 具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等重要作用[1， 2] ， 被廣泛應(yīng)用于體外免疫增強(qiáng)藥物的非特異性免疫功能評(píng)價(jià)[3] 。有很多文獻(xiàn)報(bào)到已能從多種組織和器官中分離純化巨噬細(xì)胞，但這些方法大多都是繁瑣、復(fù)雜，所需時(shí)間長且耗資較大。本實(shí)驗(yàn)以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象， 探索建立一種巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與鑒定簡便的方法。

1.材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

清潔級(jí)巴貝斯小鼠，體重在（30-32g），由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠腹腔單核巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

隨機(jī)選取巴貝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液5ml。輕柔小鼠腹部2-3min，靜置5-7min后將小鼠頸椎脫臼處死，至于解剖板上，無菌條件下打開腹腔，用注射器抽取腹腔液，離心5min （1000r/min），棄上清，用PBS洗滌2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（0.1%雙抗溶液）調(diào)節(jié)至2×106ml-1，接種于培養(yǎng)瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h，棄上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)[4]。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2巨噬細(xì)胞的觀察與鑒定

（1）臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算存活率。

4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，加少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml，用濾紙過濾，4度保存。使用時(shí)。用PBS稀釋至0.4%。（也可買Gibco的成品）； 胰酶消化貼壁細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，并作適當(dāng)稀釋。染色：細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9：1混合混勻。（終濃度0.04%） ； 計(jì)數(shù)：在三分鐘內(nèi)，分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。

（2）瑞氏染色計(jì)算細(xì)胞純度。

細(xì)胞涂片自然干燥后，用蠟筆在兩端畫線，以防染色時(shí)染液外溢。隨后將玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其蓋滿涂片，大約1分鐘后，滴加等量或稍多的II液，用吸耳球輕輕混勻。沖洗：染色5-10分鐘用流水染液，待干。 結(jié)果觀察，將干燥后的血涂片置顯微鏡下觀察。先用低倍鏡觀察涂片，再用油鏡。

2.結(jié)果

2.1小鼠巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

（1）巨噬細(xì)胞的觀察與鑒定.

巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。如圖1

（2）臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果。

從腹腔分離出來的巨噬細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞的成活率>95%，如圖2

（3）瑞氏染色結(jié)果。

從腹腔分離出來的巨噬細(xì)胞進(jìn)行瑞氏染色結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞的純度>98%，如圖3

圖1巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)24h觀察 圖2臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果

圖3 瑞氏染色結(jié)果

3.討論及結(jié)論

巨噬細(xì)胞廣泛分布于體內(nèi)，它不僅參與非特異性免疫，而且是特異性免疫中一類關(guān)鍵的細(xì)胞，參與集體眾多的生理和病理反應(yīng)過程，如巨噬細(xì)胞的吞噬和消除病原微生物[5]，通過加工處理提成抗原，啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答[6]，以及巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡清除吞噬的致病病原體等。由于腹腔巨噬細(xì)胞多游離存在于腹腔的腹水中，易于獲得，因此許多實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行基礎(chǔ)或配合臨床研究巨噬細(xì)胞功能及其與疾病的關(guān)系、或篩選免疫增強(qiáng)藥物和探討其作用機(jī)制時(shí)，往往選用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象。

雖然腹腔巨噬細(xì)胞的提取方法都是灌胃洗腹腔后，吸出含有巨噬細(xì)胞的灌洗液了，但具體操作略有差異[7]。預(yù)先注入的巨噬細(xì)胞刺激劑有淀粉溶液、肉湯、糖原等，以產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞計(jì)入腹腔。雖然這些刺激劑能分離收集到大量的巨噬細(xì)胞，但注入的大分子抗原物質(zhì)對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能有一定的影響，獲得的巨噬細(xì)胞已不再是原體內(nèi)巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)功能。本實(shí)驗(yàn)提取巨噬細(xì)胞的方法是對(duì)文獻(xiàn)中方法的改進(jìn)，關(guān)鍵在于活體腹腔注射不含血清的培養(yǎng)液，輕揉腹部后靜置幾分鐘，然后頸椎脫臼致死小鼠，無菌打開腹腔吸取腹腔液[4]。此方法相對(duì)處死小數(shù)后進(jìn)行系列操作而言，洗出的灌洗液中混雜的白細(xì)胞少，提取局勢(shì)細(xì)胞的純度高，是一種簡便的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離方法，為巨噬細(xì)胞的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]徐遠(yuǎn)義，黃允寧，常越，等.多抗甲素誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞殺傷增強(qiáng)機(jī)制的研究[J].免疫學(xué)雜志，2006，22（4）：396-398.

[2]黃瓊，李志，楊杏芬，等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2007，21（2）：140-146.

[3]張華，鐘英英，方廖瓊，等.羊胎盤免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞免疫功能的影響[J].中國生化藥物雜志，2005，26（2）：70-72.

[4]李海濤，肖丹，等.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展雜志，2008，8（4）：638-639.

[5]SO，IH，T-SH，etal.Rearrangement of action cytoskeletion during infection with Escherichia coli O157 in macrophage[J].Cell Struct Funct，1999，24（5）：237-246.

[6]Fulton SA，Reba SM，Pai PK，etal.Inhibition of major histocompatibility complex Ⅱ expression and antigen processing in murine alveolar macrophage by mycobacterium bovis BCG and the 19-kilodalton mycobacterial lipoprotein[J].Infect Immun，2004，72（4）：2010-2110.

[7]尹美珍，李世普，等.大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31（9）：40-42.