王衛(wèi)華， 宋建新

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院感染科，武漢 430030

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染過程中存在病毒免疫逃逸，可能與其從免疫耐受到免疫激活狀態(tài)過程中，T、B細胞抗原表位在面臨免疫選擇壓力時發(fā)生改變，從而使其躲過免疫系統(tǒng)監(jiān)視有關(guān)。在HBV感染自然史的不同時期中，乙肝表面抗原滴度存在顯著差異［1－5］，這一現(xiàn)象可以推測，表面抗原在HBV感染中有重要意義，其基因突變可能在慢性HBV感染的發(fā)病機制和感染自然史中發(fā)揮著潛在作用。

1 材料與方法

1.1 血清樣本及資料收集

收集2009年9月至2011年12月武漢同濟醫(yī)院收治的慢性乙肝患者280例?；颊吣挲g范圍18至70歲，其中男性175例，女性105例。入選要求：①HBsAg陽性病史大于半年。②排除甲肝、丙肝、丁肝、戊肝、艾滋病等病毒感染；排除自身免疫性肝病、淤血性肝病、酒精性肝病、代謝性肝病、藥物性肝病引起的肝炎；排除脂肪肝；③HBV熒光定量＞1×103拷貝／mL；④從未接受核苷類似物及干擾素等抗病毒治療。所有患者血清樣本均于－80℃保存，用于后續(xù)的HBV基因組DNA熒光定量檢測。

1.2 DNA提取及熒光定量

本實驗采用上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)的HBV核酸定量檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）進行檢測。按照說明書處理樣本及對照品，并配置試劑。隨后進行熒光定量PCR擴增，50℃反應(yīng)2 min，然后在94℃保溫5min，接著按照93℃30s～60℃90s的程序循環(huán)40次。在60℃時設(shè)定熒光定量PCR儀收集FAM熒光通道的信號。最后進行質(zhì)量監(jiān)控，并按儀器及軟件要求進行結(jié)果保存和數(shù)據(jù)分析。

1.3 HBV表面抗原基因克隆

根據(jù)欲擴增的HBV表面基因序列，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，進行巢式PCR擴增。根據(jù)S基因最保守的區(qū)域，我們設(shè)計一套外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物。外側(cè)引物的上游序列為5′-GGGTCACCATATTCTTGGGAAC-3′，下 游 序 列 為 5′-GGGGGTTGCGTCAGCAAACAC-3′；內(nèi)側(cè)引物上游 序 列 為 5′-ACTTTCCTGCTGGTGGCTCC-3′，下游序列為 5′-CCCAAAGACAAAAGAAAATTGG-3′。使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收擴增產(chǎn)物，與pMD19-T Vector（大連寶生物工程有限公司）連接，構(gòu)建T載體克隆，隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化已制備好的大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞進行擴增。最后用B型小量質(zhì)粒快速提取試劑盒抽提質(zhì)粒。

1.4 DNA測序

以PCR產(chǎn)物作為模板DNA測序，使用ABI PRISM3730DNA自動分析儀，按操作規(guī)程進行HBV DNA上下游序列雙向測定，測序結(jié)果用Chromas軟件轉(zhuǎn)化為FASTA格式，與GenBank上登記的HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)序列比較。

1.5 突變位點及抗原表位分析

為了便于分析，本研究將乙肝表面抗原的突變重點放在表面抗原區(qū)，共研究了15個抗原表位，其中包含兩類T細胞表位，即輔助性T細胞（Th）表位，包括 17-31 區(qū)域、37-51 區(qū)域、67-81 區(qū) 域、139-146區(qū)域、165-179區(qū)域和176-190區(qū)域；細胞毒性T淋巴細胞（CTL）表位，包括14-22區(qū)域、41-49區(qū)域、95-109區(qū)域、150-158區(qū)域、190-197區(qū)域和196－206區(qū)域。還有B細胞抗原表位，包括93-106區(qū)域、106-130區(qū)域和124-147區(qū)域。

1.6 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析。對兩組或多組間的分類變量或者連續(xù)變量進行比較，分類資料采用卡方檢驗，連續(xù)變量采用Mann-Whitney檢驗和Kruskall-Wallis檢驗等非參數(shù)檢驗。研究對象的HBV DNA水平將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為對數(shù)形式（lg）后進行分析。所有結(jié)果采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組患者臨床資料

280例慢性HBV感染者基因型均為HBV B基因型或C基因型，未發(fā)現(xiàn)其他基因型。將處于HBV感染自然史各時期的患者分為：免疫耐受（IT）組（n＝76）、免疫清除（IC）組（n＝75），不活躍（IN）組（n＝66）和 HBeAg陰性肝炎（ENH）組（n＝63）?；颊呋咎卣髟诒?中列出?；颊咧心行裕?5%）較多，乙肝病毒 B基因型毒株（76.4%）較多。在HBeAg陽性的兩組中，處于免疫耐受期的患者年齡比免疫清除期的小，同時HBV DNA含量較高而ALT值較低。在HBeAg陰性的群體中，ENH組的病毒滴度以及ALT值均高于IN組。

表1 各組患者臨床資料Table 1 Clinical data of the patients in different groups

2.2 Th抗原表位突變分析

各組HBV表面抗原Th抗原表位突變中，在4組間比較時具有統(tǒng)計學(xué)差異的是17-31、37-51、67-81等區(qū)域（P＜0.05），其余的 139-146、165-179、176-190等區(qū)域未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），如表2所示。而進一步的兩組之間的數(shù)據(jù)分析顯示，這些差異主要來自HBeAg陽性的樣本，即IT和IC組，以及HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換前后的兩組（IC和IN組）。在HBeAg陰性的兩組中差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。在17-31區(qū)域，最主要的突變發(fā)生在L21S，該突變在4組中的突變率分別為1.6%、10.0%、12.5%和16.0%。在37-51區(qū)域，IT 組發(fā)現(xiàn)1個G44E 突 變 （1.6%）；IC 組 發(fā) 現(xiàn) 了 N40S 突 變（5.0%），同時 44 位點（G44E，G44V）突變率達13.3%，47位點（T47K、V47E、T47A）突變率達到8.3%；IN組中N40S、G44E和47位點突變率分別為27.5%、17.5%和7.5%；ENH 組 N40S和 GEE4突變率分別為20.5%和6.8%。在67-81區(qū)域，IT組只發(fā)現(xiàn)I68T突變（1.6%），在IC組發(fā)現(xiàn)3個I68T突變（5.0%），IN組和ENH組I68T突變率分別為17.5%和11.4%。

2.3 CTL抗原表位突變分析

各組乙肝表面抗原CTL抗原表位突變中，在4組間比較時具有統(tǒng)計學(xué)差異的是14-22、41-49區(qū)域（P＜0.05），其余的95-109、150-158、190-197、196-206等區(qū)域未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05），如表2所示。進一步的分析同樣顯示差異主要來自于HBeAg陽性的樣本，其他的幾組樣本間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在14-22區(qū)域，最主要的突變?nèi)匀皇荓21S，4組突變率分別為1.6%、11.8%、12.5%和15.9%。41-49區(qū)域的突變情況與Th抗原表位37-51區(qū)域的突變情況一致。

表2 乙肝表面抗原各免疫抗原表位的突變情況Table 2 Mutations of the immune antigen epitopes of the hepatitis B surface antigen

2.4 B細胞抗原表位突變分析

經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，這4組患者的乙肝表面抗原B細胞抗原表位突變差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。4組中，均發(fā)現(xiàn)乙肝表面抗原免疫逃逸突變的存在。在IT組中發(fā)現(xiàn)T126S、Q129H、M133L；IC組中發(fā)現(xiàn) Q101K、T126S、M133L、M133I和M133T；IN組中發(fā)現(xiàn)M133L和M133T；ENH組中發(fā)現(xiàn)T126S、M133L逃逸突變。

3 討論

在早期的 HBV感染中，HBV準(zhǔn)種（quasispecies）沒有或者只受到很小程度的宿主免疫選擇壓力［6－7］。在十幾歲的慢性乙型肝炎患者，機體會進入一個相對活躍的免疫病毒清除期以控制病毒復(fù)制［8］。以往對HBV慢性感染史的研究發(fā)現(xiàn)，病毒的突變體與疾病的進展相關(guān)［9］，包括核苷酸和結(jié)構(gòu)的變化，如插入、缺失和刪除。普遍認(rèn)為對于病毒免疫逃逸的機制，其突變主要發(fā)生在MHC－Ⅰ細胞毒性T細胞表位內(nèi)［10］，隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)HBV核心抗原中突變累積出現(xiàn)在MHC-Ⅱ輔助性細胞表位內(nèi)［11］。除了核心蛋白，以前的研究也發(fā)現(xiàn)了在乙肝病毒S蛋白中HLA－Ⅰ類限制性抗原表位和“a”抗原決定簇內(nèi)部的突變存在很高的變異率［12－14］。對于乙肝表面抗原的研究發(fā)現(xiàn)突變累積與MHC-Ⅰ類抗原表位相關(guān)，40和47位密碼子的突變頻率大約為83%［12］。然而，以往的研究往往集中于相對后期的感染，例如，在發(fā)展為肝硬化或肝癌（通常是40歲后），或在活動期肝炎或HBeAg血清轉(zhuǎn)換后（通常圍產(chǎn)期感染的大多發(fā)生在20歲后），或者是集中于相對前期的感染，即從免疫耐受期過渡到免疫清除期的階段，而很少有文獻報道在整個HBV感染自然史中表面抗原免疫逃逸突變分布情況。

在本項研究中，我們基于HBV感染自然史中4個時期來研究表面抗原內(nèi)逃逸突變分布。按照HBV感染自然史將收集的病例分為4個時期，分別是免疫耐受期、免疫清除期、不活動期和HBeAg陰性肝炎階段。研究乙肝表面抗原Th抗原表位突變，在4組間比較時發(fā)現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)差異的是17-31、37-51、67-81 等區(qū)域 （P＜0.05），其余的 139-146、165-179、176-190等區(qū)域未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0.05）。而進一步的兩兩比較發(fā)現(xiàn)，這些差異主要來自于HBeAg陽性的樣本，即IT和IC組，以及在HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換前后的兩組中（IC和IN）。HBeAg陰性的兩組間沒有差異。在各組乙肝表面抗原CTL抗原表位突變中，4組間比較時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的是14-22、41-49區(qū)域（P＜0.05），其余的95-109、150-158、190-197、196-206等區(qū)域未發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。進一步的分析同樣顯示差異主要來自于HBeAg陽性的樣本，其他的幾組樣本間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這顯示了在HBV感染自然史中，表面抗原CTL、Th抗原表位內(nèi)突變主要發(fā)生在免疫清除期階段，在不活躍期和HBeAg陰性肝炎期并沒有顯著的增加，表明在免疫清除期的免疫壓力對于乙肝表面抗原具有重要的意義。此外，在B細胞抗原表位區(qū)域，發(fā)現(xiàn)了Q101K、P120S、T126S、Q129H、M133L、M133I、和 M133T等7個乙肝表面抗原免疫逃逸突變，這些突變在B、C基因型中的分布頻率，與全球提交的HBV序列預(yù)測的逃逸突變在各個基因型中的分布頻率幾乎完全一致，證明了HBV免疫逃逸突變在慢性乙肝中廣泛存在。說明在HBV感染的各個時期均可能影響表面抗原檢測，引起免疫球蛋白、疫苗保護失活的免疫逃逸突變的存在，這需要引起我們足夠的重視。

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