王 哲，王秋實(shí)*，劉曉玉，張殿寶

糖基化終產(chǎn)物(Advanced glycosylation end products，AGEs)是指蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或核酸等大分子在沒有酶參與的條件下自發(fā)地與葡萄糖或其他還原單糖反應(yīng)所生成的穩(wěn)定的共價(jià)物［1］。大量研究表明，糖尿病動(dòng)物和患者血中AGEs含量明顯升高，并伴有間充質(zhì)干細(xì)胞功能的損害［2］。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)作為一種更原始的MSC群，由于其無倫理問題，且來源廣泛，易采集、易擴(kuò)增等，目前已成為糖尿病患者細(xì)胞移植和基因治療的有效載體［3］。研究表明，移植臍血MSCs治療效果與MSCs的增殖能力相關(guān)，然而，細(xì)胞治療過程中，AGEs對(duì)臍血MSCs增殖的影響還不清楚?？寡趸瘎┛梢愿纳铺悄虿』颊哐趸瘧?yīng)激指標(biāo)，提示可以將抗氧化劑用于MSCs移植。普羅布考(Probucol)作為一種抗氧化劑，由于其具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用，目前已成為糖尿病患者的常用藥物。本實(shí)驗(yàn)采用含糖基化修飾的牛血清白蛋白(Advanced glycation end products－bovine serum albumin，AGE－BSA)的培養(yǎng)基對(duì)臍血MSCs培養(yǎng)，并應(yīng)用抗氧化劑普羅布考進(jìn)行干預(yù)，探討AGEs對(duì)臍血MSCs增殖的影響及普羅布考作用機(jī)制，為臨床提高干細(xì)胞移植治療糖尿病后供體干細(xì)胞的增殖能力提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 普羅布考原料藥(山東齊魯藥業(yè)有限公司)，我院臍血庫在無菌條件下取健康足月剖宮產(chǎn)新生兒臍血(經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)許可和產(chǎn)婦同意)100 mL，淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破酚邢薰?，胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，熒光標(biāo)記的抗 CD34、CD45、CD105 抗體(美國(guó)Biolegend公司)，小牛血清白蛋白和葡萄糖(美國(guó)Sigma公司)，甲基纖維素(美國(guó)Amresco 0458公司)，人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Stem Cell Technology公司)，胰蛋白酶(美國(guó) Gibco公司)，WST細(xì)胞生長(zhǎng)檢測(cè)試劑盒(日本株氏會(huì)社同仁化學(xué)研究所)，二氯醋酸熒光素(美國(guó)Sigma公司)，SOD和GSH－Px檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 糖基化修飾的牛血清白蛋白的制備與檢測(cè)

將小牛血清白蛋白50 g/L與0.5 mmol/L葡萄糖溶于磷酸鹽緩沖液中，室溫放置過夜，對(duì)照組中不含葡萄糖，其余條件一致。過濾除菌后置37℃避光孵育3個(gè)月。實(shí)驗(yàn)前置于透析膜中，去除未結(jié)合的葡萄糖。熒光光譜掃描檢測(cè)糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE－BSA)。

1.3 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離與鑒定 采集后的臍血加入等體積PBS稀釋，采用5%甲基纖維素結(jié)合Ficoll分離獲取單個(gè)核細(xì)胞。無菌條件下將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)皿進(jìn)行原代培養(yǎng)。每3 d換液1次，待細(xì)胞沿皿底生長(zhǎng)面積達(dá)80% ～90%，進(jìn)行傳代。取第3代臍血MSCs，應(yīng)用熒光標(biāo)記的抗CD34、CD45、CD105抗體，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。1.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)取消化后第3代貼壁培養(yǎng)的臍血MSCs分為BSA對(duì)照組、AGE－BSA作用組、普羅布考干預(yù)組(10、20、50、100 μmol/L)，分別于12、24和36 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行操作。

1.5 臍血MSCs及取標(biāo)本 以106個(gè)/mL濃度接種于24孔板，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，換無血清培養(yǎng)液靜止12 h，然后向普羅布考組加入普羅布考，使其終濃度分別為 10、20、50、100 μmol/L，30 min 后，分別向普羅布考組和AGE－BSA組加入AGE－BSA 100 mg/L，到各時(shí)間點(diǎn)后取細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的測(cè)定(WST法)實(shí)驗(yàn)終止前2 h，每孔加入 CKK－8 試劑20 μL，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)以酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A450值)。

1.7 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞活性氧生成的測(cè)定 收集各組細(xì)胞并重懸于300 μL Bindding Buffer中，加入10 U二氯醋酸熒光素(2HDCF－DA)輕輕混勻，室溫避光情況下反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，即為臍血MSCs內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的含量。

1.8 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，經(jīng)超聲粉碎后離心取上清進(jìn)行谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase－Px，GSH－Px)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)，操作步驟按說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 臍血間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及鑒定 原代臍血MSCs培養(yǎng)6 d后，細(xì)胞形成分散的集落，呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)飽滿(圖1a)，第3代臍血MSCs培養(yǎng)4～7 d，細(xì)胞融合鋪滿皿底，呈紡錘形、梭型、三角形等多種形態(tài)，輪廓清晰，部分胞漿形成短小突起，胞漿折光性好，胞內(nèi)顆粒少;細(xì)胞經(jīng)傳代貼壁后，細(xì)胞形態(tài)比較一致，呈成纖維狀并逐漸形成細(xì)胞集落(圖1b)，該細(xì)胞可持續(xù)傳代。第3代臍血MSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，CD105表達(dá)，而CD34和CD45不表達(dá)(圖2)。

圖1 臍血間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

2.2 普羅布考對(duì)AGE－BSA刺激下臍血間充質(zhì)干 細(xì)胞增殖的影響 與BSA對(duì)照組比較，AGE－BSA組MSCs細(xì)胞增殖明顯受抑制，普羅布考可以改善AGE－BSA刺激的增殖能力，呈時(shí)間和濃度依賴關(guān)系。普羅布考在20 μmol/L時(shí)開始顯示保護(hù)作用，隨著作用濃度升高和時(shí)間延長(zhǎng)，保護(hù)作用更加顯著。見表1。

圖2 第3代的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志

表1 普羅布考對(duì)AGEs-BSA刺激下臍血MSCs增殖的影響(OD值)

2.3 普羅布考對(duì)AGE－BSA刺激下臍血間充質(zhì)干細(xì)胞ROS含量的影響 36 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行ROS含量檢測(cè)的結(jié)果顯示，與BSA對(duì)照組比較，AGE－BSA組MSCsROS生成顯著升高，而普羅布考在10、20、50、100 μmol/L濃度范圍內(nèi)預(yù)處理30 min可以抑制AGE－BSA誘導(dǎo)的ROS生成增加，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴關(guān)系。

2.4 普羅布考對(duì)AGE－BSA刺激下臍血間充質(zhì)干細(xì)胞GSH－Px和SOD活性的影響 與BSA對(duì)照組比較，AGE－BSA組MSCs GSH－Px和SOD活性顯著下降。普羅布考在20、50、100 μmol/L濃度范圍內(nèi)預(yù)處理可以抑制AGE－BSA刺激的GSH－Px和SOD活性下降，呈時(shí)間和濃度依賴關(guān)系。見表2、表3。

表2 普羅布考對(duì)AGE-BSA刺激下臍血間充質(zhì)干細(xì)胞GSH-Px的影響(kU/L)

表3 普羅布考對(duì)AGE-BSA刺激下臍血間充質(zhì)干細(xì)胞SOD的影響(kU/L)

3 討論

高齡、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病患者的血清AGEs水平顯著升高［4］，體內(nèi)高濃度的 AGEs對(duì)臍血MSCs增殖可能起到了一定的抑制作用。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AGEs能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS生成，減少抗氧化酶生成，增強(qiáng)氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性，從而影響內(nèi)皮細(xì)胞功能［5］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，AGEs對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和功能也有一定影響［6］。有研究報(bào)道，AGEs與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生及不良預(yù)后相關(guān)［7］。然而，AGEs對(duì)臍血MSCs數(shù)量和功能的影響及可能的機(jī)制研究較少。在本研究中，我們以AGE－BSA刺激臍血MSCs后檢測(cè)臍血MSCs增殖以及細(xì)胞內(nèi) ROS濃度，發(fā)現(xiàn) AGEBSA刺激后可顯著抑制細(xì)胞增殖。AGE－BSA刺激后，臍血MSCs內(nèi)ROS濃度顯著增加。ROS可以作為第二信使觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能改變，同時(shí)，當(dāng)ROS的生成速度超過細(xì)胞自身抗氧化防御能力即可出現(xiàn)氧化應(yīng)激。有研究發(fā)現(xiàn)，高血糖能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS生成和降解的平衡影響干細(xì)胞生物學(xué)行為［8］。為進(jìn)一步研究AGEs刺激后細(xì)胞抗氧化酶的情況，筆者又檢測(cè)了臍血MSCs內(nèi)SOD和 GSH－Px的活性。結(jié)果表明，AGE－BSA能顯著下調(diào)臍血MSCs內(nèi)SOD和GSH－Px的活性。SOD為自由基清除劑，廣泛存在于各種組織中，能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷。GSH－Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要催化過氧化氫分解的酶，其特異性催化還原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)過氧化氫的分解作用。

普羅布考具有調(diào)血脂、抗氧化、抗炎、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，其抗氧化作用可能與構(gòu)效關(guān)系有關(guān)。普羅布考含14個(gè)親脂性甲基，是合成的抗氧化劑，具有極強(qiáng)的親脂性［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑可以改善糖尿病患者氧化應(yīng)激指標(biāo)，提示可以將抗氧化劑用于MSCs移植。為了進(jìn)一步證實(shí)普羅布考在AGEs引起的細(xì)胞增殖能力降低中的作用，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用抗氧化劑普羅布考進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)結(jié)果顯示，與AGEs作用組相比，普羅布考在20、50、100 μmoL 范圍內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖，下調(diào)細(xì)胞ROS水平，增加 SOD和 GSH－Px的活性(P＜0.05或P＜0.01)。由此推斷，氧化應(yīng)激在AGEs引起的臍血MSCs細(xì)胞增殖能力下降中發(fā)揮重要作用，抗氧化治療可能是提高糖尿病患者供體干細(xì)胞增殖功能的有效手段。

本研究初步證實(shí)，普羅布考保護(hù)AGEs損傷臍血MSCs生物學(xué)功能可能是通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激來實(shí)現(xiàn)的。普羅布考一方面通過抑制ROS生成，另一方面通過增加抗氧化酶類的活性，改善機(jī)體氧化和抗氧化平衡狀態(tài)，保護(hù)細(xì)胞功能。深入研究AGEs對(duì)臍血MSCs功能與活性的影響和普羅布考保護(hù)作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用抗AGEs生成和抗氧化等干預(yù)方法來提高干細(xì)胞移植治療糖尿病后供體干細(xì)胞的增殖能力提供新的理論依據(jù)。

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