張 良

蜂膠是經(jīng)驗(yàn)豐富的工蜂采集生命力極強(qiáng)的白楊、白樺、榕樹等嫩芽和花蕾及樹脂類物質(zhì)，歸巢后幾番吐哺，與其舌腺分泌物混合而制成的膠粘物質(zhì)。蜂膠乙醇提取物(EPF)中含有豐富的黃酮類化合物、脂肪酸及酯類、氨基酸、維生素和多種活性酶類。研究發(fā)現(xiàn)，蜂膠黃酮(EPF)對(duì)環(huán)磷酰胺(CTX)致肝正常細(xì)胞HL-7702損傷具有保護(hù)作用，為證實(shí)此觀點(diǎn)，筆者進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，旨在進(jìn)一步研究并證實(shí)EPF對(duì)化療藥物損傷的保護(hù)作用，為進(jìn)一步將其開發(fā)為新型高效的天然抗腫瘤藥物和細(xì)胞保護(hù)劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 EPF:由日本醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)中心采用乙醇提取，紫外光譜鑒定并定量檢測。人正常肝細(xì)胞(HL-7702)由日本醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究中心提供。WST-1凋亡檢測試劑盒、Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自Qiagen公司;氧化氫酶(CAT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)等活性及尿素氮(BUN)試劑盒、EB/溴化乙錠、吖啶橙購自羅氏公司。BALB/C野生型小鼠，6周齡(購自日本琦玉縣KUREA株式會(huì)社)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 在含10%滅活新生牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代一次。細(xì)胞生長曲線實(shí)驗(yàn):將對(duì)數(shù)生長期的HL7702細(xì)胞用0.25%胰酶消化，含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/mL，每孔100 μL，分別加入到4塊96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h細(xì)胞貼壁后，向各孔中分別加入 CTX 4 ng/L、EPF(20、30、40 ng/L，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔)。分別培養(yǎng)24 h，PBS沖洗3次后，各孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL WST-1，繼續(xù)在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。酶標(biāo)儀測定各孔OD值(光密度)，空白孔調(diào)零，選擇450 nm為測定波長、630 nm為參考波長，以藥物濃度為橫坐標(biāo)、OD為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，確定結(jié)果穩(wěn)定性。

1.2.2 蜂膠黃酮提取 稱取蜂膠1.0 g，乙醇加至100 mL，漩渦混合，超聲波發(fā)射器超聲20 min，500 r/min離心2 min，重復(fù)超聲處理20 min，反復(fù)上述步驟2次，70%乙醇溶解并紫外光譜分析儀鑒定，陽性對(duì)照為蘆丁。

1.2.3 吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染色實(shí)驗(yàn)24孔板按5×104個(gè)細(xì)胞/孔密度接種細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后向各孔中分別加CTX(4 ng/L)、EPF(20、40、60 ng/L)，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，每孔分別加200 μL AO染液(100 mg/L)及 200 μL EB 染液(100 mg/L)，室溫放置5 min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 Annexin-V-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞處理方法同上，PBS清洗細(xì)胞2次，0.25%胰酶消化細(xì)胞，500 r/min離心5 min收集細(xì)胞。收集1×106單細(xì)胞懸液，加入Binding buffer 100 μL和 Annexin-V-FITC(20 μg/mL)10 μL，室溫避光30 min。加入 PI(50 μg/mL)5 μL，用 Binding buffer加至400 μL，用FACS進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測。

1.2.5 動(dòng)物模型 健康鼠隨機(jī)均分為5組，雌雄各半。對(duì)照組灌胃生理鹽水;模型組單獨(dú)給予CTX;3個(gè)劑量試驗(yàn)組每天分別灌服樣品100、200、400 mg/mL，0.5 mL/只，連續(xù)給藥 10 d，同時(shí)注射CTX 0.15 g/kg，共3 d。小鼠眼眶取血檢測外周血象，肝素抗凝，根據(jù)試劑盒操作過程分析檢測血清檢測中各項(xiàng)酶的指標(biāo)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，兩組均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPF對(duì)CTX誘導(dǎo)的HL7702生長抑制影響對(duì)人肝細(xì)胞系HL7702生長增殖的影響，如圖1所示，在單獨(dú)存在CTX(4 ng/L)時(shí)，HL-7702均處于生長抑制狀態(tài);加入EPF時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長抑制明顯改善，并隨著EPF多肽濃度的增加，當(dāng)EPF濃度達(dá)到40 ng/L時(shí)，促進(jìn)生長作用顯著增加，各組與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果顯示，EPF對(duì)CTX誘導(dǎo)的HL7702生長抑制具有拮抗作用。

圖1 EPF對(duì)CTX處理HL-7702的保護(hù)作用

2.2 EPF對(duì)CTX誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞凋亡形態(tài)影響 見圖2。結(jié)果顯示，單獨(dú)應(yīng)用CTX(4 ng/L)組，絕大部分細(xì)胞核被染成橙紅色，核皺縮或碎裂，為晚期凋亡或死亡細(xì)胞。EPF與CTX聯(lián)合應(yīng)用，EPF肽強(qiáng)烈抑制CTX對(duì)HL7702的損傷作用。凋亡細(xì)胞明顯減少，絕大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)飽滿，幾乎沒有死亡細(xì)胞。AO/EB染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從形態(tài)角度觀察，EPF對(duì)CTX誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞凋亡形態(tài)影響具有抑制作用。

圖2 EPF對(duì)CTX處理的HL7702AO/EB雙染結(jié)果

2.3 EPF對(duì)CTX誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞凋亡影響Annexin-V-FITC/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。CTX單獨(dú)處理的HL7702細(xì)胞組24 h晚期凋亡細(xì)胞占30.2%，CTX與EPF共處理細(xì)胞組凋亡細(xì)胞分別占19.2%、13.1%和7.1%，隨著EPF濃度增加，凋亡細(xì)胞逐漸減少，活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞明顯增多。CTX單獨(dú)處理的HL7702細(xì)胞組24 h早期凋亡細(xì)胞占57.2%，CTX與EPF共處理細(xì)胞組凋亡細(xì)胞分別占29.7%、17.1%和9.5%，隨著EPF濃度增加，早期凋亡細(xì)胞逐漸減少，活細(xì)胞明顯增多。

2.4 EPF對(duì)小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影響 如圖4所示，模型組小鼠血清CAT、LDH、CK、GOT和GPT等酶活性以及血清BUN含量與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然而此類CTX介導(dǎo)的毒性反應(yīng)均在一定程度上被EPF緩解。

圖3 EPF對(duì)CTX處理的HL7702細(xì)胞凋亡率影響

圖4 EPF對(duì)小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影響

3 討論

惡性腫瘤的治療手段有多種，化療仍是目前極為重要的基本手段之一［1-2］，且存在靶向性差異。多數(shù)抗腫瘤藥物均可在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，無選擇地破壞正常組織，造成廣泛與嚴(yán)重的急/慢性蓄積毒性，導(dǎo)致化療藥物的劑量限制而引起治療指數(shù)狹小的不良反應(yīng)，限制了癌癥治療的最佳用藥［3］。同時(shí)，化療藥物作用可引起機(jī)體衰弱、消化障礙、骨髓抑制等不良反應(yīng)也是終止腫瘤治療的主要原因，因此，在抗腫瘤治療時(shí)，能最大程度地殺傷腫瘤細(xì)胞且對(duì)正常組織破壞最小已經(jīng)成為化療藥物臨床應(yīng)用的目標(biāo)。其相關(guān)研究也是當(dāng)今抗腫瘤藥物研究與開發(fā)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)［4］。

蜂膠是蜜蜂從植物的幼芽和枝條上采集的樹脂類物質(zhì)，蜂膠提取物無明顯肝腎功能損害。其在不同地區(qū)化學(xué)成分各異，生理活性亦不同。筆者采用乙醇純化方法提取的蜂膠主要成分為黃酮類。黃酮化合物有抗菌、抑制腫瘤細(xì)胞生長、降壓、預(yù)防紫外線損傷等作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)EPF具有較好的化療保護(hù)功能，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)。為探求EPF對(duì)于CTX損傷HL7702細(xì)胞的保護(hù)作用，本研究采用WST-1細(xì)胞增殖試驗(yàn)。WST-1是一種類似于MTT的化合物，是MTT的升級(jí)替代產(chǎn)品，WST-1和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。故實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加精確可信。

在本研究中，在HL7702細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入CTX和不同濃度的EPF(20～40 ng/L)，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞的增殖抑制在EPF濃度達(dá)到20 ng/L后得到改善，EPF濃度到40 ng/L后具有明顯的保護(hù)作用，同樣 AO/EB雙染實(shí)驗(yàn)和 Annexin-V-FITC/PI流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也支持這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步確定EPF對(duì)CTX化療損傷的保護(hù)作用，這可能與EPF具有抗氧作用有關(guān)。EPF可以清除體內(nèi)過多的自由基，減少自由基對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞的損傷，維持體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡，有效抑制CTX造成的機(jī)體自由基損傷［5-6］，表現(xiàn)為血清CAT下降，同時(shí)對(duì)CTX導(dǎo)致的肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，表現(xiàn)為GOT與GPT下降。本研究顯示，CPF具有對(duì)CTX引起的化療損傷較明顯的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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