【摘 要】堿性磷酸酶基因表達載體的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達就是從大腸桿菌的pET-44a-BAP質(zhì)粒中亞克隆編碼堿性磷酸酶的基因BAP，通過設(shè)計BAP的特異性引物獲得大量BAP基因片段，構(gòu)建pMD19-T-BAP克隆載體，進行酶切，再構(gòu)建pET-his-BAP表達載體，轉(zhuǎn)化BL21，成功表達出BAP基因的蛋白產(chǎn)物。

【關(guān)鍵詞】堿性磷酸酶；基因表達；載體；大腸桿菌

引 言

堿性磷酸酶（Alkaline phosphamse）是一個非特異性磷酸單酯酶，能催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應(yīng)，產(chǎn)生無機磷酸和相對應(yīng)的醇、酚或糖。堿性磷酸酶既是生物體內(nèi)一種重要的調(diào)控酶；也是基因工程、臨床診斷的一種重要工具酶，已廣泛應(yīng)用于疾病檢測、食品檢驗、醫(yī)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域。本實驗通過亞克隆、連接、酶切等不同的技術(shù)手段，構(gòu)建堿性磷酸酶基因表達載體，在大腸桿菌中得以表達。

1、材料

1.1 實驗儀器。電熱恒溫水浴鍋，電子分析天平，磁力攪拌器，高速冷凍離心機，分光光度計，4度冰箱，搖床，微量移液器，渦旋振蕩器，電泳儀，PCR儀，超凈工作臺，滅菌鍋。

1.2 試劑及溶液。Tris，考馬斯亮藍，氫氧化鈉，氯化鈉，95%乙醇，鹽酸，SDS， 瓊脂，酵母提取物，乙酸（TAE）緩沖液，LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化試劑。

1.3 菌種和質(zhì)粒。DH5a菌，BL21（DE3）菌，PET-his 菌。PET-his， pET-44a-BAP。

2、方法

2.1 引物的設(shè)計。根據(jù)pET-44a-BAP上插入的BAP序列，用primer primer 5.0 軟件設(shè)計引物。引物序列如下：上游引物 5′cggacaccagaaatgcct 3′；下游引物5′gccgctctggggctgaaa 3′

2.2 堿性磷酸酶基因的PCR擴增。在0.2mLPCR微量離心管中按下列劑量配制50μL反應(yīng)體系：其中Premix Taq酶：45μL、模板質(zhì)粒pET-44a-BAP：1μL、引物1：1μL、引物2：1μL、Ddwater：2μL，總體積為50μL。PCR結(jié)束后，取9μL產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

2.3 DH5a和BL21（DE3）感受態(tài)的制備。將菌液分裝到1.5mL預(yù)冷的無菌離心管中，冰上放置10min，然后于4℃，5000r/min離心10min。棄上清后，加入1mL的0.1mol/LCaCl2 溶液，混勻，插入冰中放置30min。4℃，5000r/min離心10min。棄上清后，用1mL的0.1mol/LCaCl2 溶液垂懸，插入冰中放置30min。4℃，5000r/min離心10min。棄上清液后，用200μL 0.1mol/LCaCl2 溶液垂懸，超凈工作臺中按每管100μL分裝到1.5mL的無菌微量離心管中，4℃保存。

2.4 PMD19-T-BAP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和檢測

2.4.1 PCR產(chǎn)物與T載體直接連接

2.4.2 DH5a的轉(zhuǎn)化

2.4.3轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定

2.5 pET-his及BAP的酶切和回收

0.5mL離心管中混合下列溶液：Pet-his /PMD19-T-BAP質(zhì)粒：34μL、Quick HindIII：1μL、Quick BamHI：1μL、10× Quick buffer：4μL，總體積為40μL?；靹?，瞬時離心。37℃水浴中酶切30min。取9μL酶切產(chǎn)物，與已知分子量的DNA對比電泳，以確認酶切是否成功。

回收酶切后的目的片段：柱平衡。向膠塊加700μLPN，50℃水浴10min。加到吸附柱CA2中，置2min，12000rpm離心1min，倒廢液。加600μL漂洗液PW，離心1min，倒廢液。重復上述步驟?？辙D(zhuǎn)2min，放3min晾干。將吸附柱放到干凈的離心管中，加50μL洗脫緩沖液EB，置2min，離心2min，收集DNA溶液。4℃保存。

2.6 pET-his-BAP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和檢測

2.6.1 BAP與pET-his大片段連接

2.6.2 BL21（DE3）的轉(zhuǎn)化

2.6.3轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定

2.7 pET-his-BAP的誘導表達

OD值為0.5時可進行誘導表達。除BL21（DE3）空菌不加IPTG以外，其余的每管都加3μLIPTG，37℃搖菌。含有pET-his-BAP重組載體的菌液1.5-3h梯度搖菌。1.5h，2h，2.5h，3h時各取1.5mLpET-his-BAP重組載體的菌液2500r/min離心15min，倒上清，加入20μL的ddwater震蕩混勻后加入20μl的上樣緩沖液，封口煮沸5min，立即插入冰中。

2.8 堿性磷酸酶表達的SDS-PAGE檢測

進行SDS電泳，用考馬斯亮藍染色。清水中過夜脫色，觀察結(jié)果。

3、結(jié)果與分析

3.1堿性磷酸酶基因的PCR擴增。PCR擴增了兩管，各取9μl點樣電泳。跑出很亮的條帶。

3.2 PMD19-T-BAP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和檢測。將PMD19-T-BAP導入到DH5a，涂平板培養(yǎng)。產(chǎn)生白色菌落。挑取3個單菌落（白1、白2、白3）至每管3ml的LB培養(yǎng)基里，搖菌。白3清亮，沒有菌絲。從而將白1、白2進行提質(zhì)粒。

3.3 pET-his及BAP的酶切和回收。pET-his質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物進行電泳，條帶很亮，與Marker相比也符合事實，與pET-his大片段對應(yīng)的大樣進行回收，得到pET-his大片段。對pMD19-T-BAP質(zhì)粒酶切產(chǎn)物進行電泳，結(jié)果與預(yù)期相符，對與目的基因?qū)?yīng)的大樣進行回收，得到BAP片段。

3.4 pET-his-BAP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化和檢測。從轉(zhuǎn)化的BL21（DE3）中提取質(zhì)粒，進行酶切，再電泳。B1和B2各有極微弱的兩條帶。與pET-his質(zhì)粒相比它們跑得慢。因此兩條帶里跑得快的是目的基因。這表明pET-his-BAP質(zhì)粒成功的導入到BL21（DE3）菌中。成功導入pET-his-BAP質(zhì)粒的BL21（DE3）菌經(jīng)過IPTG誘導，表達出相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物。

結(jié) 語

堿性磷酸酶是早期成骨細胞分化的標志物，在骨礦化過程中的主要作用是為骨礦化提供無機磷酸鹽（Pi），同時水解無機焦磷酸（PPi），抑制PPi 對羥磷灰石的抑制作用。目前，ALP主要用于肝臟和骨骼等疾病診斷，由于ALP還有一種胎盤型，因此現(xiàn)在也用于孕婦孕期的檢查。妊娠期觀察孕婦血清中ALP的規(guī)律變化是判斷胎盤發(fā)育正常與否的良好指標。這證實了本實驗的可行性以及往后生物學領(lǐng)域中堿性磷酸酶基因的發(fā)展前途。也為微生物發(fā)酵實驗室以及生化實驗室進一步的研究探討奠定了扎實的基礎(chǔ)。

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