王方方，孫沛勇，銀會娟，尹 迪

（河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司，河南 南陽 473000）

目前，世界各國經(jīng)濟(jì)發(fā)展都面臨能源供應(yīng)安全和生態(tài)環(huán)境保護(hù)的雙重壓力，為了實現(xiàn)能源、環(huán)境和經(jīng)濟(jì)的持續(xù)協(xié)調(diào)發(fā)展，各國都在致力于可再生能源的開發(fā)和研究[1-2]。乙醇除廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、化工等領(lǐng)域外，還被公認(rèn)為最具有發(fā)展前景的可再生清潔能源之一。我國燃料乙醇產(chǎn)業(yè)從2001年起步，現(xiàn)己擴(kuò)大到十幾個省份。2002年國家在黑龍江、河南、安徽三省新上了3個總設(shè)計規(guī)模為90萬噸的建設(shè)項目[3-5]。2005年世界乙醇的總產(chǎn)量達(dá)到108億加侖，2000～2005年其產(chǎn)量以平均每年18.5%的速度遞增[6]。未來乙醇的應(yīng)用主要體現(xiàn)在3個方面：車用燃料、燃料電池的燃料以及成為支撐現(xiàn)代以乙烯為原料的石化工業(yè)的基礎(chǔ)原料。目前世界乙醇產(chǎn)量的80%以上是通過釀酒酵母以淀粉質(zhì)或其他糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)的[7]。為了提高淀粉利用率，降低糧耗，獲得高產(chǎn)酒精酵母菌株顯得尤為重要。新的微生物菌種決定著微生物代謝產(chǎn)品，但菌種的生產(chǎn)能力高低，則決定著微生物產(chǎn)品的開發(fā)和生產(chǎn)前景，因此，微生物的誘變育種是極其重要的環(huán)節(jié)[8]。近期利用常壓室溫等離子體技術(shù)對酒精酵母進(jìn)行誘變處理，效果比較理想。

常壓室溫等離子體（atmospheric room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)具有射流溫度低、產(chǎn)生的等離子體均勻、無需真空裝置、操作簡易、成本低、與生物大分子和細(xì)胞作用明顯等優(yōu)點[9-10]，已成為快速突變微生物基因組的有效方法。前期的研究結(jié)果表明，ARTP技術(shù)可以快速有效地突變細(xì)菌、微藻、酵母菌等微生物[11-12]。

對酒精酵母來說發(fā)酵終了酒精含量是一個重要指標(biāo)，其測定方法使用蒸餾法[13]。本研究通過對出發(fā)菌株和誘變后單菌落進(jìn)行發(fā)酵實驗，綜合比較實驗結(jié)果，進(jìn)行復(fù)篩-再復(fù)篩的驗證以及遺傳穩(wěn)定性的實驗，以確定出最優(yōu)突變株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：自制麥芽汁，濃度12°Bx～14°Bx，121℃、30min滅菌；斜面：在麥芽汁中加入1.8%（w/v）的瓊脂粉，121℃、30min滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基：生產(chǎn)用糖化醪，100℃、90min滅菌。

菌株：生產(chǎn)用酵母菌。

1.2 儀器與設(shè)備

ME403E電子天平：梅特勒-托利多；SHP-80（D）電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；ZHWY-211C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LDZX-150KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)及保存方法

誘變前處理：原種由斜面活化后，挑取適量接入種子培養(yǎng)基中，28℃、150r/min培養(yǎng)12h；誘變后篩分：平板單菌落接入種子培養(yǎng)基，于28℃進(jìn)行液體試管培養(yǎng)，16h后轉(zhuǎn)接入三角瓶進(jìn)行28℃、150r/min搖床培養(yǎng)，9h后轉(zhuǎn)接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵實驗；保存方法：4℃低溫保存。

1.3.2 ARTP誘變方法

誘變至對數(shù)生長期的酵母種子液經(jīng)預(yù)處理后涂布于載片表面，將載片置于載臺上，用ARTP誘變育種系統(tǒng)2mm射距照射，分別照射0s、15s、30s、45s、60s、75s、90s、120s、150s、180s，將經(jīng)過處理后的載片放于裝有1mL生理鹽水的離心管中，振蕩均勻后稀釋至10-1、10-2、10-33個梯度，每個梯度涂布平板2個。

1.3.3 分析方法[13]

酒精度測定分析方法：準(zhǔn)確量取發(fā)酵醪100mL，注入1000mL平底燒瓶內(nèi)，加水120mL，將平底燒瓶和冷凝器連接好，注意勿使漏氣。置電爐上加熱蒸餾，餾出液收集于100mL量筒內(nèi)，當(dāng)餾出液達(dá)到100mL刻度時，取下?lián)u勻，以酒精度計與溫度計同時測其酒度和溫度，根據(jù)酒精度和溫度換算表，換算為20℃時的酒精度。

1.3.4 計算公式

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變致死率曲線的測定

前期研究發(fā)現(xiàn)，等離子體對細(xì)菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及蛋白質(zhì)都有顯著的作用效果，處理時間長會導(dǎo)致細(xì)胞壁部分或者完全的破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)蛋白[14]。這是由于等離子體產(chǎn)生的活性粒子能夠破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)也能夠穿過細(xì)胞壁到達(dá)細(xì)胞內(nèi)，打斷基因、蛋白鍵等，從而導(dǎo)致大部分微生物死亡[15]。但少數(shù)經(jīng)過ARTP照射的微生物會通過本身的自動修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)存活，并在這一過程中產(chǎn)生基因突變。因此，選擇合適的ARTP操作條件能夠?qū)崿F(xiàn)微生物的快速誘變。

由圖1可知，等離子體對酵母菌的殺傷力有一個突變的過程，處理時間低于60s時，酵母菌的致死率為0；處理時間為75s時，致死率約為24%；而處理時間為90s時，有一個顯著突變，從24%躍升為90%，因此可以確定酵母的致死時間為90s。由于菌株的突變具有隨機(jī)性，其致死率和突變率及突變方向的關(guān)系不是十分清楚，與誘變方法和菌種本身的特性密切相關(guān)。本實驗選取致死率在90%以上的單菌落進(jìn)行篩分實驗。

圖1 酒精酵母的致死率曲線Fig.1 Fatality rate curve of alcohol-producing yeast

2.2 酵母突變體的篩分實驗

由于實驗條件所限，對于酵母突變體的篩分實驗選用傳統(tǒng)的篩分方法。從ARTP處理并經(jīng)梯度稀釋得到的平板上挑取單菌落，接種至10mL裝量的液體試管中，28℃培養(yǎng)16h，接入裝有80mL培養(yǎng)基的小三角瓶中，28℃、150r/min搖床培養(yǎng)，8h后接入270g發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%，34℃靜置培養(yǎng)。發(fā)酵期間進(jìn)行定時稱質(zhì)量，以失質(zhì)量不超過0.2g/h為發(fā)酵終點。

對初篩試驗的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，參照不同的突變標(biāo)準(zhǔn)得出的正負(fù)突變率數(shù)值見表1。

表1 不同突變標(biāo)準(zhǔn)下正負(fù)突變率結(jié)果統(tǒng)計Table 1 Positive or negative mutation rate under different mutation standards

突變標(biāo)準(zhǔn)是指（目標(biāo)菌酒精度/出發(fā)菌酒精度-1）*100%所得的結(jié)果。從表1結(jié)果可以看出，菌株發(fā)生正負(fù)突變的情況均有發(fā)生，且隨著突變標(biāo)準(zhǔn)的不斷提高，負(fù)突變率結(jié)果逐漸高于正突變率。對于突變標(biāo)準(zhǔn)超過3%的5個菌株，其發(fā)酵酒精度和糖醇轉(zhuǎn)化率見表2。

表2 較優(yōu)突變株的初篩結(jié)果Table 2 Preliminary screening result of excellent mutant strains

表2中Y2和Y4酒精度較低，是因為發(fā)酵培養(yǎng)基初始濃度低的原故。因為發(fā)酵所使用的糖化醪直接從生產(chǎn)上糖化罐中取用，不同的配料批次糖化醪濃度存在一定的差別。

2.3 較優(yōu)突變株的復(fù)篩實驗

為了驗證突變株的發(fā)酵實驗結(jié)果，對初篩中發(fā)酵結(jié)果比較理想的5株突變株Y1、Y2、Y3、Y4和Y5和出發(fā)菌株再連續(xù)進(jìn)行2次發(fā)酵實驗，發(fā)酵結(jié)果見表3。

表3 較優(yōu)突變株的復(fù)篩結(jié)果Table 3 Rescreening result of excellent mutant strains

從表3發(fā)酵結(jié)果可以看出，這5株菌發(fā)酵穩(wěn)定性和平行性較好，其發(fā)酵結(jié)果趨勢比較一致。

2.4 遺傳穩(wěn)定性實驗

通過初篩和復(fù)篩實驗結(jié)果可以看出，篩選出的5株突變株較出發(fā)菌株酒精度有一定程度的提高。為了檢測篩選出菌株的遺傳穩(wěn)定性，對突變株進(jìn)行傳代，并對某些傳代次數(shù)的突變株進(jìn)行發(fā)酵實驗，實驗結(jié)果見表4。

表4 較優(yōu)突變株遺傳穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 4 Genetic stability experiments result of excellent mutant strains

分析結(jié)果表明，等離子誘變的酵母突變株都保持著良好的遺傳穩(wěn)定性。

2.5 發(fā)酵期間失重情況變化

圖2 酵母菌發(fā)酵期間失重情況Fig.2 Weight loss during alcohol-producing yeast fermentation period

從圖2酵母菌發(fā)酵失重情況可以看出，菌株的發(fā)酵周期分為延遲期、對數(shù)期以及穩(wěn)定期。剛接入發(fā)酵培養(yǎng)基時，菌株需要一個逐漸適應(yīng)新環(huán)境的過程，此為延遲期，該階段菌種的發(fā)酵表現(xiàn)為延遲，失重緩慢；菌株適應(yīng)新環(huán)境后，快速利用培養(yǎng)基中的糖分，發(fā)酵迅速；發(fā)酵后期，培養(yǎng)基中糖分基本消耗殆盡，發(fā)酵緩慢，失重情況趨于穩(wěn)定。對比出發(fā)菌株，突變株在發(fā)酵前期速度慢于出發(fā)菌株，隨著發(fā)酵過程的不斷進(jìn)行，突變株失重逐漸超過出發(fā)菌株，至發(fā)酵結(jié)束，失重高于出發(fā)菌株。通過失重情況可初步判斷突變株的發(fā)酵結(jié)果優(yōu)于出發(fā)菌株。

3 結(jié)論

通過系列實驗結(jié)果可知，ARTP誘變育種方法可快速有效地誘變酒精酵母，而且突變效果良好。通過對近100個單菌落的初篩，以發(fā)酵終酒精度為指標(biāo)，其中正突變率超過3%的突變株有5個。通過對5個較優(yōu)突變株的反復(fù)篩分，確定其突變效果。并對具有優(yōu)良突變效果的突變株進(jìn)行數(shù)次傳代，通過實驗驗證突變株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

[1]FARRELL AE,PLEVIN R J,TURNER BT,et al.Ethanol can contribute to energy and environment goals[J].Science,2006,311(27):506-508.

[2]ROBERT F.Cellulosic ethanol：Biofuel researchers prepare to reap a new harvest[J].Science,2007,315(16):1488-1491.

[3]沈 煜，王 穎，鮑曉明，等.釀酒酵母木糖發(fā)酵酒精途徑工程的研究進(jìn)展.生物工程學(xué)報，2003，19（5）：636-641.

[4]NISSEN TL,KIELLAND-BRANDT MC,NIELSEN J,et al.Optimization of ethanol production inSaccharomyces cerevisiaeby metabolic engineering of the ammonium assimilation[J].Metab Eng,2000,2(1):69-77.

[5]Ethanol’s potential:looking beyond corn data[OL].http://www.earth-policy.Org/Updates/2005/Update49data.htm,2005.

[6]BJORKQVIST S,ANSELL R,ADLER L,et al.Physiological response to anaerobicity of glycerol-3-phosphate dehydrogenase mutants ofSaccharomyces cerevisiae[J].Appl Environ Microb,1997,63(1):128-132.

[7]ANDRE L,HEMMING A,ADLER L.Osmoregulation inSaccharomyces cerevisiaeStudies on the osmotic induction of glycerol production and glycerol 3-phosphate dehydrogenase(NAD+)[J].FEBS Lett,1991,286(1-2):13-17.

[8]NISSEN TL,SCHULZE U,NIELSEN J,et al.Flux distributions in anaerobic，glucose-limited continuous cultivations ofSaccharomyces cerevisiae[J].Microbiology,1997,143(1):203-218.

[9]LI HP,LI G,SUN WT,et al.Radio-frequency,atmospheric-pressure glow discharges:producing methods,characteristics and applications in bio-medical fields[J].Complex Syst,2008,982(2):584-591.

[10]LI G,LI HP,WANG LY,et al.Genetic effects of radio-frequency,atmosphericpressure glow discharges with helium[J].App Phys Lett,2008,92(22):221504.

[11]WANG LY,HUANG ZL,LI G,et al.Novel mutation breeding method forStreptomyces avermitilisusing an atmospheric pressure glow discharge plasma[J].J Appl Microbiol,2010,108(3):851-858.

[12]WANG LY.Studies on the mechanisms and applications of the atmospheric room temperature plasmas acting on the microbes[D].Beijing:Tsinghua University,2010.

[13]MILLER SM,MAGASANIK B.Role of the complex upstream regioll of the GDH2 gene in nitrogen regulation of the NAD-linked glutamate dehydrogenase inSaccharomyces cerevisiae[J].Mol Cell Biol,1991,11(12):6229-6247.

[14]POMPL R,JAMITZKY F,SHIMIZU T,et al.The effect of low-temperature plasma on bacteria as observed by repeated AFM imaging[J].New J Phys,2009,11(11):115023.

[15]MORFILL GE，KONG MG，ZIMMERMANN JL.Focus on plasma medicine[J].New J Phys,2009,11(11):115011.