王麗，賈曉健，姜華軍，杜郁，楊帆，司書毅，洪斌

心血管疾病是當今世界發(fā)病率最高的疾病之一，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要病理基礎，而脂質代謝紊亂是公認的危險因子。長期的臨床研究表明，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的降低（＜ 40 mg/dl）是心血管疾病獨立而重要的危險因子。美國心血管疾病藥物專家 Rader 提出，降低心血管疾病危害的下一個目標就是尋找能夠提高 HDL-C 水平和（或）增強 HDL 功能的藥物和治療方案[1]。研究表明，HDL 最重要的抗動脈粥樣硬化機制是促進膽固醇的逆轉運（reverse cholesterol transfer，RCT），即膽固醇從外周組織向肝臟轉運并排出的過程[2]。高密度脂蛋白受體 SR-BI（人 SR-BI 又稱 CLA-1）作為 HDL 受體，通過上調其表達可促進 HDL-C 直接轉運至肝臟并最終被排出，加速膽固醇的逆轉運，因此，SR-BI 被認為是一個潛在的預防和（或）逆轉動脈粥樣硬化的新靶點[3-4]。除轉錄水平的調控外，mRNA 的穩(wěn)定性相關的轉錄后水平調控是基因表達水平的另一個重要調控機制，RNA 結合蛋白通過識別特定的 mRNA 3' 非翻譯區(qū)（3' untranslated region，3'UTR）的順式作用元件來影響 mRNA 的半衰期，參與 mRNA 穩(wěn)定性、基因表達定位以及翻譯效率等調控[5]。目前，對于基因 mRNA 穩(wěn)定性的調控已成為藥物發(fā)現(xiàn)的潛在靶點[6]。

本研究以人 HDL 受體 SR-BI/CLA-1 基因3'UTR 介導的 mRNA 穩(wěn)定性為靶點，將 SR-BI/ CLA-1 基因 3'UTR 大約 1200 bp 的全長片段克隆至熒光素酶報告基因的下游，構建受 SR-BI/ CLA-1 基因 3'UTR 調控的重組熒光素酶報告質粒 pc-luc-3'UTR 以及 pGL3-CLAp-luc-3'UTR，并獲得了穩(wěn)定轉染 pGL3-CLAp-luc-3'UTR 的 HepG2 細胞的單克隆細胞株，為進一步研究 SR-BI/CLA-1 表達調控機制以及針對人 SR-BI/CLA-1 基因 mRNA 穩(wěn)定性的表達上調劑高通量篩選模型的建立奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株和細胞株 質粒載體 pGEM-T、真核細胞表達載體 pGL3-Basic 和 pcDNA3.1 均 為美國 Promega 公司產品；大腸桿菌 E. coli DH5α 和人肝癌細胞株 HepG2 為本實驗室保存。

1.1.2 工具酶和主要試劑 Pfu DNA 聚合酶購自上海生工生物工程公司；T4 DNA 連接酶、限制 性內切酶等均購自大連寶生物工程公司；DNA 回收試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；PureYield? 中量質粒提取試劑盒、細胞裂解液及熒光素酶檢測系統(tǒng)、SV 總 RNA 提取試劑盒均購自美國 Promega 公司；轉染試劑 Lipofectamine? 2000、SuperScript III First-Strand 逆轉錄試劑盒均購自美國 Invitrogen 公司；實時熒光定量 RT-PCR 試劑盒（FastStart Universal SYBR Green PCR Master）購自瑞士 Roche 公司；MEM 細胞培養(yǎng)基購自美國 Thermo 公司；胎牛血清、丙酮酸鈉、非必需氨基酸和 G418 抗生素購自美國 Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）購自美國 Sigma 公司。 1.1.3 儀器 MiniCycle PTC-200 型 PCR 儀為美國 MJ Research 公司產品；EnVision 多功能微 孔板檢測儀為美國 PerkinElmer 公司產品；iQ5 Multicolor real time PCR 儀為美國 Bio-Rad 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 目的片段的獲得 以人肝癌細胞株 HepG2 基因組 DNA 為模板，PCR 擴增獲得 CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 全長序列（1 ～ 959 bp，1 為終止密碼子），上、下游引物分別為 5' GCTCTAGATGCCTTTCTCCACAG GGTCC 3'，5' GCTCTAGA GGGCGTACTCATGCAG TAT 3'（下劃線為 Xba I 酶切位點）。PCR 體系反應條件為 94 ℃ 變性 5 min；94 ℃ 變性 50 s， 60 ℃ 退火 50 s，72 ℃ 延伸 60 s（30 個循環(huán)）；72 ℃ 10 min。將 PCR 擴增產物回收純化并連接至 pGEM-T 載體，轉化 E. coli DH5α 感受態(tài)宿主菌，通過藍白斑篩選獲得重組單克隆。提取純化質粒，酶切鑒定陽性克隆，將該重組質粒命名為 pGEM-3'UTR，測序鑒定。

1.2.2 重組質粒的構建和鑒定 將 pGL3-Basic 質粒通過 Hind III 和 Xba I 雙酶切獲得熒光素酶報告基因的 DNA 序列，并連接至 pcDNA3.1 載體多克隆位點，獲得重組質粒 pc-luc。將上述獲得的測序正確的 CLA-1 mRNA 3'UTR 片段克隆至 pc-luc 質粒中熒光素酶報告基因的下游 Xba I 位點處，經插入方向鑒定正確后最終獲得重組質粒 pc-luc-3'UTR。與此同時，將該 CLA-1 mRNA 3'UTR 片段克隆至之前構建的重組質粒 pGL3-CLAp-luc[7]中熒光素酶報告基因的下游 Xba I 位點處，獲得同時克隆有 CLA-1 基因啟動子區(qū)（CLAp）和其 3'UTR 片段的重組熒光素酶報告質粒 pGL3- CLAp-luc-3'UTR，轉染后獲得穩(wěn)定轉染細胞株 CLAp-luc-3'UTR HepG2。該質粒同時可檢測化合物對 CLA-1 啟動子活性或 3'UTR 相關的 mRNA 穩(wěn)定性的影響，因此后續(xù)模型的建立在該質粒的基礎上進行。

1.2.3 細胞培養(yǎng)及轉染 HepG2 細胞培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、1 mmol/L 丙酮酸鈉和 1% 非必需氨基酸的 MEM 培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。0.25% 胰酶加 0.02% 乙二胺四乙酸（EDTA）消化傳代。轉染用質粒的提取方法按 PureYield? 中量質粒提取試劑盒說明書進行。將 1 × 105個HepG2 細胞接種于 30 mm 培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁生長匯聚程度達到 80% 左右時，利用脂質體 Lipofectamine?2000 將 pc-luc-3'UTR 瞬 時轉染至 HepG2 細胞，轉染 6 h 后更換培養(yǎng)液，24 h 后對熒光素酶活性進行檢測，以確定最優(yōu)轉染效率。

1.2.4 穩(wěn)定轉染細胞株的構建 將瞬時轉染 pGL3-CLAp-luc-3'UTR 質粒的細胞以 5 × 103個細胞/孔接種于 96 孔板，于 37 ℃、5% CO2條件下進行培養(yǎng)，以含 700 μg/ml G418 的 MEM 選擇培養(yǎng)液篩選穩(wěn)定轉染細胞株，每 3 天更換培養(yǎng)液。 2 周后，選擇存活的細胞集落進行擴大培養(yǎng)，并測定熒光素酶的活性，將活性較高的細胞集落以 1∶2 的比例進行分級稀釋，篩選穩(wěn)定轉染的單克隆細胞株，傳代并進行觀察和熒光素酶活性測定，最終獲得呈現(xiàn)正常細胞周期、能夠穩(wěn)定傳代 20 代以上的高表達熒光素酶活性的細胞株，命名為 CLAp-luc- 3'UTR HepG2。

1.2.5 實時熒光定量 PCR 待測化合物作用于 HepG2 細胞后，提取細胞的總RNA，采用試劑盒 SuperScript III First-Strand 合成 cDNA，采用 2 × TaqMan?gene expression master mix 進行熒光定量 PCR 反應，利用軟件分析并計算 Ct 值。以 GAPDH 為內參，采用相對 Ct 的方法對熒光素酶基因的轉錄水平進行定量。

1.2.6 基因 mRNA 半衰期測定 待測化合物作用細胞 10 h 后在培養(yǎng)基中分別加入 5 μg/ml 放線菌素 D 以終止轉錄。加入放線菌素 D 后的 0、30、60、90 min 分別提取細胞總 RNA，進行定量 分析。待測基因 mRNA 水平與時間的相關性，其斜率為降解常數(shù) kd，由此計算待測基因 mRNA 的半衰期（t1/2= 0.693/kd）。

2 結果

2.1 CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 序列的獲得

由于 CLA-1 基因 3'UTR 位于一個外顯子中，因此我們以人基因組 DNA 為模板，PCR 擴增得到 CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 序列，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示獲得預期大小的 DNA 片段（圖 1A）。將該 PCR 產物克隆至 pGEM-T 載體中，并對該插入片段進行序列測定，結果表明 該片段與 GenBank 中報道的序列一致，符合預期設計。

圖1 CLA-1 基因 3'UTR 序列的 PCR 擴增產物（A）和 pc-luc-3'UTR（B）、pc-luc-CURE（C）酶切鑒定結果 Figure 1 PCR product of human CLA-1 gene mRNA 3'UTR (A) and restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid pc-luc-3'UTR (B) and pc-luc-CURE (C)

2.2 報告基因重組質粒 pc-luc-3'UTR 的構建

對構建的重組質粒 pc-luc-3'UTR 進行酶切鑒定，結果顯示 CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 序列以正確的方向插入到 pc-luc 中熒光素酶報告基因的下游 Xba I 位點處（圖 1B），構建示意圖見圖 2A。其中，不含 3'UTR 的質粒 pc-luc 作為對照質粒。另外，為了驗證 CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 的作 用，根據(jù)文獻[8]報道人工合成了一段已知的保守的 CURE（CU-rich element）序列，構建了 3' 端含有 CURE 的熒光素酶報告質粒 pc-luc-CURE，酶切鑒定結果如圖 1C 所示。上述重組質粒均以 pcDNA3.1 質粒自身強啟動子 pCMV 為啟動子。

2.3 CLA-1 基因 3'UTR 對 mRNA 穩(wěn)定性的影響

將含有 CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 序列的重組質粒 pc-luc-3'UTR 轉染HepG2 細胞后檢測熒光素酶活性，結果顯示，與對照質粒 pc-luc 相比，pc-luc-3'UTR 轉染細胞的熒光素酶活性顯著降低，而 pc-luc-CURE 則未見明顯變化（圖 2B）。此外，我們利用實時熒光定量 RT-PCR 的方法檢測了分別轉染pc-luc、pc-luc-3'UTR 和 pc-luc-CURE 后 HepG2 細胞的熒光素酶 mRNA 水平，結果與熒光素酶活性結果一致（圖 2C）。進而對 pc-luc-3'UTR 轉染 HepG2 細胞的熒光素酶的半衰期進行了檢測，結果顯示 CLA-1 3'UTR 的存在顯著降低了熒光素酶 mRNA 的穩(wěn)定性，半衰期由 81.5 min 縮短至 44.4 min（圖 2D）。綜上結果表明，CLA-1 基因 3'UTR 對熒光素酶活性及其 mRNA 水平和穩(wěn)定性有顯著影響。

2.4 穩(wěn)定轉染細胞株 CLAp-luc-3'UTR HepG2 的建立和應用

由于自身啟動子可更好地反映細胞中基因的表達調控狀況，于是我們將CLA-1 基因 3'UTR 克隆至先前構建的帶有 CLA-1 啟動子的熒光素酶報告質粒 pGL3-CLAp-luc[6]中熒光素酶報告基因下游，構建重組報告質粒 pGL3-CLAp-luc-3'UTR，并建立穩(wěn)定轉染 pGL3-CLAp-luc-3'UTR 的 HepG2 細胞，以 CLAp-luc HepG2 細胞作為對照。重組質粒構建示意圖見圖 3A、3B。

進而采用熒光素酶報告基因和實時熒光定量 RT-PCR 的方法對構建的 CLAp-luc-3'UTR 細胞和 CLAp-luc 對照細胞的熒光素酶活性、報告基因 mRNA 水平及半衰期進行了檢測，結果如圖 3 所示。CLA-1 基因 3'UTR 的存在可顯著降低模型熒光素酶活性及其 mRNA 水平，同時熒光素酶報告基因的半衰期也從 16.2 h 縮短至 2.2 h，與前期構建的 pc-luc-3'UTR 模型結果基本一致。上述結果確證了 CLA-1 基因 3'UTR 的序列中存在對其 mRNA 穩(wěn)定性有顯著影響的順式元件，使其 mRNA的降解率大大提高。綜上結果，本文證實了 CLA-1 基因 3'UTR 的存在對其 mRNA 穩(wěn)定性的影響。

圖2 CLA-1 基因 3'UTR 對 mRNA 穩(wěn)定性的影響（A：重組質粒 pc-luc-3'UTR 構建示意圖；B：CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 降低熒光素酶的活性；C：CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 降低熒光素酶基因 mRNA 的水平；D：CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 降低熒光素酶基因 mRNA 的穩(wěn)定性） Figure 2 The effect of CLA-1 gene 3'UTR on luciferase mRNA stability (A: Illustration of recombinant plasmid pc-luc-3'UTR construction； B: The effect of CLA-1 gene 3'UTR on luciferase activity； C: The effect of CLA-1 gene 3'UTR on luciferase mRNA level； D: The effect of CLA-1 gene 3'UTR on luciferase mRNA stability)

3 討論

心血管疾病是全球范圍造成死亡的首要原因，動脈粥樣硬化以富含脂肪的斑塊在大動脈壁聚積為主要特征。盡管他汀類藥物能減少約 30% 的冠狀動脈事件[9]，但每年仍有 9% 的患者受到殘余心血管病變風險的困擾[10]，因此亟需新作用機制調血脂藥物的研發(fā)。近年來，SR-BI 的抗動脈粥樣硬化作用成為研究熱點，相關研究逐步揭示肝上 HDL 受體介導的 HDL-C 的選擇性攝取將外周組織中的膽固醇轉運到肝臟進行處置代謝，是膽固醇逆轉運機制的終末步驟，也是最重要的步驟之一，通過上調其表達可促進 HDL-C 直接轉運至肝臟并最終被排出，加速膽固醇的逆轉運。因此，SR-BI 被認為是一個潛在的預防和（或）逆轉動脈粥樣硬化的新的治療靶點[1,11]。

SR-BI 在包括肝臟在內的多種組織中表達，在巨噬細胞上也有表達，但在細胞膽固醇外排中的作用尚存在爭議。SR-BI 在肝臟中的基因表達調控在脂代謝過程中尤為重要，受到飲食、激素、膽固醇代謝及藥物等的調節(jié)。目前針對 SR-BI 基因表達調控機制的研究主要集中在基因轉錄水平的調控，其中 SREBP、Sp1、LRH-1 等轉錄因子和 PPARγ、PXR、FXR、LXR 等核受體在調節(jié) SR-BI 表達的過程中發(fā)揮了重要的作用[12]?；诖?，我們在之前工作中構建了 SR-BI/CLA-1 轉錄上調劑篩選模型，經篩選獲得了以 TSA 為代表的多個活性化合物，并進一步在細胞水平上對其 CLA-1 表達上調活性及其作用機制進行了研究[13-14]。針對 SR-BI/ CLA-1 基因轉錄后水平的研究尚未見報道。

圖3 CLA-1 基因 3'UTR 對 mRNA 穩(wěn)定性的影響（A：對照質粒 pGL3-CLAp-luc 構建示意圖；B：重組質粒 pGL3-CLAp-luc-3'UTR 構建示意圖；C：CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 降低熒光素酶的活性；D：CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 降低熒光素酶基因 mRNA 的水平；E：CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 降低熒光素酶基因 mRNA 的穩(wěn)定性） Figure 3 The effect of CLA-1 gene 3'UTR on luciferase mRNA stability (A: Illustration of control plasmid pc-luc construction； B: Illustration of recombinant plasmid pGL3-CLAp-luc-3'UTR construction； C: The effect of CLA-1 gene 3'UTR on luciferase activity； D: The effect of CLA-1 gene 3'UTR on luciferase mRNA level； E: The effect of CLA-1 gene 3'UTR on luciferase mRNA stability)

與基因轉錄調控相比，目前人們對于轉錄后調控細節(jié)還所知甚少，但這方面的研究正日益受到重視。人 LDL 受體（LDLR）的 3'UTR 對其 mRNA 穩(wěn)定性起重要作用，研究發(fā)現(xiàn)天然產物小檗堿能夠通過作用于人 LDLR 的 3'UTR 從而增加 LDLR 基因 mRNA 的穩(wěn)定性，以不同于他汀類藥物的作用機制提高 LDLR 的表達水平，降低血漿中 LDL-C 水平，有可能發(fā)展為新型降血脂藥物，并可與他汀類藥物聯(lián)用[6]。另外，Benjamin 等[15-16]利用綠色熒光蛋白作為報告基因構建了克隆有 IL-3、TNFα 基因 3'UTR 的重組報告質粒，以此為基礎獲得可增加這些細胞因子 mRNA 穩(wěn)定性的表達調控劑。已報道的轉錄后調控相關的順式作用元件包括 ARE（AU-rich element）、CURE、GRE（GU-rich element）、PRE（pyrimidine-rich element）等。RNA 結合蛋白通過識別特定的 3'UTR 順式作用元件來決定 mRNA 的半衰期和降解率，參與 mRNA 的穩(wěn)定性、基因表達的定位以及翻譯效率等生理過程的調控[5]。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn) microRNA（miRNA）可通過與靶基因 mRNA 的 3'UTR 上的特定區(qū)域通過完全或不完全堿基互補結合，介導 mRNA 的降解或翻譯抑制，從而在轉錄后水平調控靶基因的表達，成為轉錄后水平調控研究的新熱點。最新報道發(fā)現(xiàn) miR-33 可通過直接靶向 ABCA1/G1 基因 3'UTR 區(qū)，在轉錄后水平抑制 ABCA1 和 ABCG1 基因的表達，從而調控了細胞內膽固醇代謝平衡[17-19]。因此，轉錄后調控是除轉錄水平調控外的另一個重要的基因表達調控機制，已成為藥物發(fā)現(xiàn)的重要靶點。

人 HDL 受體基因 CLA-1 轉錄并加工成熟的 mRNA 全長 2759 bp，其3'UTR 序列長 1234 bp，由第 13 個外顯子編碼。不同種屬的 SR-BI 基因 3'UTR 區(qū)域中存在高度保守序列，提示其具有轉錄后調節(jié)機制。本研究結果顯示，將 CLA-1 基因 3'UTR 構建至熒光素酶報告基因 3' 端，可明顯降低熒光素酶活性及基因 mRNA 的穩(wěn)定性（圖 3），說明除轉錄水平的調控外，SR-BI/CLA-1 基因 mRNA 3'UTR 介導的 mRNA 的穩(wěn)定性相關的轉錄后調控也是其基因表達水平的另一個重要調控機制，可以作為上調 CLA-1 表達的一個新靶點，為后續(xù)針對 SR-BI mRNA 穩(wěn)定性為靶點的模型建立提供了依據(jù)。

以本研究獲得的穩(wěn)定轉染細胞 CLAp-luc- 3'UTR HepG2 為基礎建立篩選模型，不僅可以獲得上調 CLA-1 啟動子活性的化合物，同時還可獲得增加 CLA-1 基因 3'UTR 介導的 mRNA 的穩(wěn)定性的化合物，這為 CLA-1 表達上調劑的發(fā)現(xiàn)提供了更為有效可靠的基礎。另外也可用于參與調控 SR-BI/CLA-1 表達的 miRNAs 篩選和作用機制研究。這些活性化合物或 miRNAs 的發(fā)現(xiàn)，一方面可以大大豐富 CLA-1 基因表達上調劑的候選物，并有可能和 CLA-1 基因轉錄上調劑聯(lián)合作用，更好地上調 CLA-1 基因的表達，為最終發(fā)現(xiàn)高效、低毒的基于 HDL 的抗動脈粥樣硬化藥物奠定基礎；另一方面，這些活性化合物或 miRNAs 還將有助于深入探討 CLA-1/SR-BI 基因 3'UTR 的轉錄后調控機制，對于探索開發(fā)新型基于 HDL 抗動脈粥樣硬化藥物具有重要的科學意義和應用價值。

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