胡穎，張連海，宋麗潔，王易雪，季加孚

樣本質(zhì)量是整個樣本庫的核心，樣本應(yīng)該在盡可能嚴格的條件下進行采集、處理、保存、運輸以及后期加工。樣本庫的工作就是盡可能地將對樣本質(zhì)量的影響降低到最小，除了嚴格質(zhì)量管理的制度外，新技術(shù)的不斷研發(fā)、理論研究的不斷豐富將有助于評估影響樣本質(zhì)量的因素，從而制定或改進有關(guān)樣本的標準流程以盡量減少樣本質(zhì)量的變化，保持樣本的原有性質(zhì)。

目前將影響樣本質(zhì)量以及最終影響樣本相關(guān)檢測結(jié)果的因素籠統(tǒng)地分為兩類：分析前因素或變量（pre-analytical factors or variables）與分析因素（analytical factors）。其中，分析前因素對樣本質(zhì)量的影響較大，而分析因素主要是在分析過程中采用對照、標準化等措施盡可能減少分析前因素造成的影響，盡量反映樣本的真實情況，它也決定了最終的分析結(jié)果。

因此，在進行樣本分析之前，首先要了解有多種因素決定樣本的質(zhì)量——分析前因素或變量。這些分析前因素，包括生物變異、樣本收集、處理和貯存等的技術(shù)差異，將導(dǎo)致分析前樣本的狀態(tài)與樣本在患者體內(nèi)的狀態(tài)存在差異。

1 生物樣本質(zhì)量的影響因素

1.1 分析前因素

分析前因素按照時間先后可劃分為三類：樣本采集前患者狀態(tài)；樣本的采集以及樣本采集后到分析前所經(jīng)歷的處理過程[1]。表 1 列舉了常見的影響樣本質(zhì)量的分析前因素。

表1 常見的影響樣本質(zhì)量的分析前因素

1.1.1 樣本采集前患者的狀態(tài) 研究表明分析物的水平可能會受各種因素影響，如患者的整體健康狀態(tài)、采樣前攝入的食品和飲料、用藥情況、甚至采集所處一天內(nèi)的時間。額外的因素，如女性月經(jīng)周期的不同階段也可能會影響一些下游的分析，應(yīng)努力收集和記錄有關(guān)這些變量的信息。

1.1.2 樣本的采集過程 從患者處收集生物樣本可能會影響生物樣本的質(zhì)量。相關(guān)研究已經(jīng)明確表明，在生物樣本離體后熱缺血的時間會影響分析結(jié)果的總體特征和水平[2]。因此，生物樣本從患者體內(nèi)取出后應(yīng)該盡快保存，比如分割成適當(dāng)?shù)拇笮。焖倮鋬龌蛘叻湃脒m當(dāng)?shù)谋Ｗo液中保存。當(dāng)生物樣本從患者處采集時，生物樣本被移除的位置（如腫瘤或非腫瘤，以及在腫瘤內(nèi)部的位置），任何被使用的麻醉劑，組織器官血液斷流的時間，任何在切除后用于穩(wěn)定保存生物樣本的試劑，各種類型的固定方式和暴露在各種固定試劑中的時間，以及生物樣本在采集后所處的溫度都可能會影響分子的穩(wěn)定性和降解的速度。

因此，在收集離體后的生物樣本時，應(yīng)該有計劃地對生物樣本進行適當(dāng)?shù)淖⑨尅＿@些注釋應(yīng)該包括患者的信息和采集、處理的時間，例如清潔劑的類型、樣本處理過程中石蠟的類型和溫度等。這些數(shù)據(jù)應(yīng)該保存在一個數(shù)據(jù)庫里以便隨時查閱。

1.1.3 分析前的樣本處理 盡所有可能嘗試并優(yōu)化處理，從而將生物樣本處置過程中的分子變化降低到最小。這不僅包括生物樣本處理的溫度和時間，還應(yīng)考慮諸如以何種大小和容量的容器進行存儲，以備將來使用。較小的樣本僅允許盡可能少的凍融。當(dāng)樣品存儲在冰凍狀態(tài)下時，它們被冷卻到儲存溫度的速率也會影響分子降解的速度。儲存到樣本應(yīng)用前的其他因素，諸如運輸條件、溫度變化等也會影響到樣本的質(zhì)量，從而影響到樣本最終的檢測結(jié)果。

針對以上這些分析前因素，美國國家癌癥研究所生物樣本庫和生物樣本研究辦公室推薦使用代碼形式進行標識[3]。該標識將組織和血液樣本進行了區(qū)分。雖然增加了工作量，但是的確為今后樣本流程持續(xù)改進提供了重要證據(jù)。該編碼系統(tǒng)針對液體和固體采用不同的代碼，代碼為 7 位，分別代表樣本的多項分析前參數(shù)，下面是采用該代碼的實例：

液體 PL2-SED-B-B-E-A-G

（PL2）樣本類型：血漿 2 次離心；（SED）儲存容器：EDTA 抗凝；（B）離心前時間：3 ～ 7 ℃，< 2 h；（B）離心：< 3000 × g，室溫 10 min；（E）二次離心：室溫 10 min （3000 ～ 6000）× g；（A）離心后時間：< 1 h，3 ～ 7 ℃；（G）儲存條件：–85 ～ –60 ℃ 細管儲存。

固體 TIS-BPS-N-B-RNL-A-A

（TIS）樣本類型：固體組織；（BPS）采集類型：活檢；（N）熱缺血時間：不適用（例如活檢）；（B）冷缺血時間：2 ～ 10 min；（RNL）固定類型：RNA later；（A）固定時間：< 15 min；（A）儲存條件：PP 管 0.5 ～ 2 ml，–85 ～ –60 ℃。

這種使用代碼標識的方法，較為規(guī)范地給每份樣本附上分析前因素的情況，雖然繁瑣，但方便了今后對樣本的質(zhì)量進行追溯。

1.2 分析因素

當(dāng)樣本進入特定的分析階段時，分析前因素帶入特定分析中，將給分析結(jié)果帶來不同程度的影響。而分析因素主要是在分析過程中采用對照、標準化等措施盡可能減少分析前因素造成的影響，盡量反映樣本的真實情況。同時，分析因素也可以增加檢測的可重復(fù)性，確保試驗結(jié)果穩(wěn)定可靠。實際操作中，應(yīng)考慮以下的分析相關(guān)因素：①為確保研究的準確性，有可能的話，盡量進行驗證研究；②對技術(shù)人員進行檢測流程的標準化培訓(xùn)；③試劑種類、批號盡量保持一致；④包含適當(dāng)類型和數(shù)量的質(zhì)量控制（參考）樣品；⑤研究過程中樣本的取舍應(yīng)該盡量做到隨機；⑥采用標準化的方法來記錄和解釋測試結(jié)果。

將影響樣本質(zhì)量的分析前因素與分析因素進行細化，可以提高樣本的質(zhì)量，但更為重要的是通過這樣接近量化的標識與管理，為樣本庫標準作業(yè)程序（standard operation procedure，SOP）[4-5]的建立提供可以量化的依據(jù)。為了獲得高質(zhì)量的樣本，減少不規(guī)范操作流程對樣本質(zhì)量造成的影響，增加后續(xù)分析結(jié)果的可靠性，需要建立標準操作規(guī)程，并通過測量因素對結(jié)果的影響不斷地改進現(xiàn)有的標準作業(yè)程序。也就是：樣本的日常工作所參照的作業(yè)指導(dǎo)書所基于的證據(jù)的主要來源是分析前后樣本的檢測數(shù)據(jù)，通過詳細記錄分析前變量，結(jié)合之后的分析結(jié)果，測算變量對結(jié)果的影響，從而得出評估現(xiàn)行的 SOP 流程規(guī)劃，提出改進的意見與建議。

2 樣本質(zhì)量的評估

由于分析前因素的存在，因此需要對樣本質(zhì)量進行測定，從而了解在生物樣本的采集、處理、儲存、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)中的處理方式對樣本分子水平的變化，乃至測試結(jié)果的影 響[6]。對樣本質(zhì)量進行評估應(yīng)該是較為全面的，或有針對性的，樣本質(zhì)量評估通常是指從病理形態(tài)、分子水平和特定指標等方面對樣本進行評價并判斷其是否符合質(zhì)量標準。通過分析庫存標本的 DNA、RNA、蛋白質(zhì)或者特定的分子成分，定期對保存的樣本質(zhì)量進行監(jiān)控，了解樣本質(zhì)量，同時探索影響樣本質(zhì)量的因素，從而有效地對樣本庫流程進行持續(xù) 改進。

對于樣本質(zhì)量評估，首先要明確的一個概念就是評價樣本好壞的標準并不是一成不變的“死標準”。不同樣本和對樣本的不同使用要求決定了樣本質(zhì)量標準和檢測方法不盡相同。針對進行某一特定研究內(nèi)容的特定類型的樣本，質(zhì) 量檢測過程應(yīng)該建立標準的流程，使用標準參考方案、標準品、標準參考試劑，以及盡可能使用質(zhì)量穩(wěn)定的可參考標準生物樣本（例如質(zhì)量確認的體外培養(yǎng)細胞）等，并保證標準品的研究結(jié)果可重復(fù)。

另外，由于現(xiàn)有技術(shù)水平的限制，檢測生物樣本中每一個部分的質(zhì)量情況是不可能實現(xiàn)的，因此，目前檢測通常只評價某一特定環(huán)境條件下生物樣本分子成分的總體穩(wěn)定程度。如果后期研究中將主要涉及某一個或多個特定的分子，就必須就這些特定的分子針對性地進行檢測。

檢測的方案盡量采用經(jīng)典的、廣泛認可的試驗技術(shù)。但即便是那些經(jīng)典的技術(shù)，也應(yīng)該反復(fù)測定以保證技術(shù)本身隨時間的變化仍能保持穩(wěn)定。國際生物和環(huán)境資源協(xié)會推薦“能力證據(jù)”測試（“proof of performance” test），即在一定時間范圍內(nèi)測試復(fù)制的同一樣本，以測算檢測方法的標準偏差。通過確立類似這樣的檢測，以確保存儲和處理過程有利于保證生物樣本中分子成分與質(zhì)量。其中內(nèi)容有：

2.1 質(zhì)量評估需制定標準和建立標準化操作程序

每個生物資源庫都應(yīng)有一套完整的樣本質(zhì)量評估體系。樣本庫應(yīng)根據(jù)質(zhì)量管理的要求，樣本質(zhì)量保證的標準以及樣本庫的實際情況，建立適合本樣本庫的質(zhì)量管理體系并形成書面文件，然后實施和保持并持續(xù)改進以保證體系的有效性。評估的準確性和穩(wěn)定性受操作水平的影響，因此，應(yīng)保證評估人員必須是獨立的，有經(jīng)驗或者經(jīng)過相關(guān)培訓(xùn)。

2.2 建立定期隨機抽檢機制

質(zhì)量評價是一個系統(tǒng)性的工作，需要建立完善的制度保證其規(guī)律實施，這個制度就是定期隨機抽檢機制。定期隨機抽檢就是周期性地從樣本庫保存的所有樣本中按照隨機抽樣的原則，抽取一定比例的樣本進行質(zhì)量評價。根據(jù)樣本評價結(jié)果判斷樣本儲存是否存在問題，進而及時發(fā)現(xiàn)問題并改正。

2.3 重視質(zhì)量反饋

生物樣本庫的一個重要作用是為研究人員提供實驗樣品。樣本庫在向使用者提供樣本的同時應(yīng)該將該樣本相關(guān)的質(zhì)量評估信息同時提供給使用者，以便使用者判斷該樣本是否能用于特定的研究。同時，樣本的使用過程本身就是對樣本質(zhì)量進行檢測的過程，因此使用者對樣本質(zhì)量的反饋信 息對于樣本質(zhì)量控制有著重要意義，應(yīng)該予以重視。根據(jù)反 饋意見評估樣本的質(zhì)量，并改進采集、儲存以及處理樣本的方法。

2.4 確認過程中人員的職責(zé)

確認程序應(yīng)對確認過程中樣本庫相關(guān)人員的具體責(zé)任做出明確的規(guī)定，一般而言，安排如下：①樣本庫負責(zé)人批準選用的檢驗方法；②技術(shù)負責(zé)人負責(zé)對檢測方法進行確認和評審，以及對作業(yè)指導(dǎo)書進行審核；③實際檢測人員負責(zé)編制檢測方法作業(yè)指導(dǎo)書，并驗證檢測方法。

2.5 質(zhì)量檢測的內(nèi)容

樣本庫儲存的樣本一般為組織樣本、血液樣本以及提取的衍生分子樣本等。針對不同樣本可選用不同方法從病理形 態(tài)、分子水平上對樣本進行評估。目前沒有特別理想的針對血液（比如血清、血漿等）的通用質(zhì)量檢測手段，嚴格的流程質(zhì)量控制是目前血液類樣本主要的質(zhì)量保證手段。目前較多質(zhì)量評估的方法主要是針對冰凍組織樣本。

2.5.1 組織樣本病理評價 通常的組織樣本在進入樣本庫前或者進入后的短時間內(nèi)，需要對樣本的病理狀況進行評 價。有時也將評價放在后續(xù)項目研究前進行。但是無論如何，組織樣本的病理評價都應(yīng)該是必須的（圖 1）。

圖1 冰凍組織的病理檢測報告

圖2 常見的組織樣本 RNA 質(zhì)量檢測結(jié)果

樣本庫儲存的樣本會與實際整體樣本存在差異。盡管樣本通常都會附有相關(guān)采集單位的病理報告，但是由于采集部位與實際病理取材部位在組織器官內(nèi)部的差異，樣本庫實際保存的樣本與病理報告中的組織仍存在一定差異，有時這種 差異會大到足以影響研究的結(jié)果。以惡性腫瘤為例，常見的不一致包括：腫瘤含量與分布、分化程度、腫瘤亞類的區(qū)別等。舉個實際遇到的例子：病理由于多點取材而且切片面積較大，報告腫瘤組織中同時含有腺癌成分與內(nèi)分泌癌成分，而樣本研究前冰凍組織切片病理顯示細胞形態(tài)與腺癌不同，后免疫組化考慮取材樣本為神經(jīng)內(nèi)分泌癌來源。

此外，筆者對同一樣本、同一次取材的不同分裝進行病理分析發(fā)現(xiàn)，雖然是同一樣本的同一次取材，但是分裝不同，組織內(nèi)的分化程度和腫瘤含量比例也不同。另外，還有一點容易忽略的是當(dāng)病理診斷醫(yī)師采用的標準不同時，也會導(dǎo)致數(shù)據(jù)差異較大，因此，盡量采用相同的標準，必要時需要與病理醫(yī)師進行溝通。

在完成病理評估之后，往往要根據(jù)研究內(nèi)容的需要對組織進行修剪，諸如去掉多余的間質(zhì)成分，比如 RNA 表達的研究往往要求腫瘤組織成分在 70% 以上，而 DNA 水平的研究對組織成分的要求會更高。

對于活檢組織樣本的病理評估一般較難，冰凍切片后往往組織損失較大，活檢當(dāng)時的組織印片是一個比較可行的病理評估手段。

總之，忽略研究前對生物組織樣本的病理評價將對結(jié)果產(chǎn)生嚴重的影響。

2.5.2 常見生物樣本的總體分子水平評價 一般來說，樣本庫的質(zhì)量評價很少針對特定的分子指標，往往是總體分子水平的評價。一般來說，RNA 相對于 DNA 更容易發(fā)生破壞和降解，通常多數(shù)研究者將 RNA 的完整性作為評價樣本質(zhì)量的重要指標。而特定的分子水平或者特定分子的評價需要有針對性地完成。

由于 DNA、RNA、蛋白的提取方法在一般的分子生物學(xué)指南中都有詳細描述，這里就不再敘述。常見的質(zhì)控報告見圖 2。

總之，通過對生物樣本質(zhì)量影響因素的細化分析，對影響因素進行詳細記錄，歸納總結(jié)，并通過技術(shù)手段對這種影響因素進行量化，將有助于樣本庫正確流程的不斷改進。

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