周軍年，裴雪濤

2012 年 10 月 8 日，英國發(fā)育生物學家約翰·格登爵士（John B. Gurdon）和日本生物醫(yī)學家山中伸彌（Shinya Yamanaka）因“發(fā)現(xiàn)成熟細胞可以被重編程（reprogrammed）為多能性（pluripotency）”而獲獎，這次獲獎是在短短五年時間內干細胞領 域的第二次獲獎，上一次獲獎是在 2007 年，馬 丁·埃文斯因 1981 年成功分離出小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）而與另外兩名從 事“基因打靶”（gene targeting）的科學家馬里 奧·卡佩基、奧利弗·史密斯共享諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

在 2006 年之前，通過體細胞重編程獲得多能干細胞的辦法有兩個，即核移植（nuclear transfer）和細胞融合（cell fusion）。而核移植領域正是由 1962 年約翰·格登的具有劃時代意義的實驗所開 辟的，時年 29 歲的格登在完成博士學位時通過實驗把蝌蚪分化細胞的細胞核移植進入卵母細胞質中，并培育出成體爪蟾，這是人類第一次從動物的成體細胞中克隆出一個新的動物，當 1997 年多利羊誕生之后，這種克隆技術才被人們廣為所知。第一個進行細胞核移植的科學家是德國的漢斯·斯 佩曼（Hans Spemann，1935 年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎獲得者），他在 1938 年時發(fā)現(xiàn)，把發(fā)育早期的蠑螈細胞核移植到去除了細胞核的發(fā)育晚期蠑螈胚胎中，胚胎細胞可以繼續(xù)發(fā)育成為一個完整的蠑螈。既然單獨的細胞核移植就可以讓生物由一個細胞逐漸分化發(fā)育為一個完整的個體，那么這種現(xiàn)象就一定不會局限于胚胎細胞中。成體細胞是否也可采用類似技術重新發(fā)育成一個完整個體？因為在當時看來，胚胎細胞和成體細胞至少在基本結構上沒有什么本質性的區(qū)別，都是由細胞核與細胞質構成的。毫無疑問，格登為這個問題提供了圓滿的答案。核移植技術具有非常好的臨床應用前景，尤其是在制備患者特異性的細胞來源方面，這也是約翰·格登獲得諾貝爾獎的重要原因。

既然核移植和細胞融合能夠使體細胞重編程，那么卵母細胞質和 ESCs 中必然存在某些因子能賦予體細胞多能性。然而在相當長的一段時間里，科學家們一直認為發(fā)育生物學上的“金科玉律”是不可打破的，即已經(jīng)分化了的細胞是不可能逆轉其發(fā)育生物學命運的。1987 年，Davis 等[1]報道通過過表達 MyoD，可以將成纖維細胞轉分化為肌細胞，這對后來的山中伸彌是一個很大的啟發(fā)，提示可以通過過表達特定的轉錄因子將體細胞重編程為多能干細胞?；诖送茰y，1999 年，在山中伸彌申請到奈良科學與技術學院助教授職位后即開始從事相關研究。在經(jīng)過 7 年的痛苦歷程后，終于從 24 個候選基因中篩到了 4 個與 ESCs 多能性密切相關的轉錄因子 Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，即 Yamanaka 因子，結果顯示通過逆轉錄病毒轉染這 4 個分子到小鼠成纖維細胞中，能夠獲得與 ESCs 特性基本相同的多能性干細胞系，將其稱為誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells, iPS cells），該研究結果在 2006 年發(fā)表后引起了極大的轟動[2]，隨后在 2007 年底，人 iPS 細胞同樣被三個不同的研究小組成功建立[3-5]。從第一次獲得小鼠胚胎干細胞[6]到 1998 年 Thomson 第一次獲得人類胚胎干細胞[7]，經(jīng)歷了 17 年，然而在這次里程碑式的發(fā)現(xiàn)浪潮中，科學家們用了很短的時間即實現(xiàn)了從小鼠 iPS 細胞到人 iPS 細胞的飛越。

但此前已有的關于 iPS 的研究，無一例外地采用了逆轉錄病毒載體將特定組合的編碼轉錄因子的基因導入體細胞，存在潛在的致癌風險，這是人們最為擔心的問題之一，也是 iPS 技術從實驗室推向臨床應用所面臨的巨大障礙，因此在后續(xù)的以應用為目的的研究過程中，研究者主要是緊緊圍繞兩個問題展開研究，即“安全性”和“有效性”，其中，以“安全性”為主，兼顧“有效性”，因而在重編程方法上進行了很多卓有成效的改進和研究（表 1）。

表1 重編程方法總結和比較[8]

表2 重編程中使用的激活因子及靶標[8]

除了轉染方法和手段的改進，在重編程因子上也實現(xiàn)了去除 c-Myc 的因子組合[9]，并篩選了新的因子組合如 Oct4、Nanog、Sox2、Lin28[10]等，大大提高了 iPS 的安全性，但與此同時 iPS 產生效率也大大下降，因此研究者們根據(jù)重編程機制的研究篩選了一系列可以提高重編程效率的激活因子，包括小分子化合物、特異性 miRNAs、RNA 干涉策略等（表 2），尤其是小分子化合物大大加速了未來潛在的臨床應用，而避開了繁瑣的遺傳轉錄因子介導的緩慢的重編程過程。

在 iPS 起源的種子細胞上，目前為止已經(jīng)成功地從成纖維細胞[2-5]、B 淋巴細胞[11]、T 淋巴細 胞[12]、胰腺細胞[13]、胃細胞[14]、肝細胞[14]、甚至腫瘤細胞[15]等幾乎所有類型的成體細胞獲得了 iPS 細胞。

與核移植不同的是，與已分化細胞相比，成體干/祖細胞更容易被重編程為 iPS。如 Hochedlinger 實驗室發(fā)現(xiàn)，造血干/祖細胞形成 iPS 的效率是終末分化的 B 細胞和 T 細胞的 300 多倍，形成率超過 28%[16]。而采用人臍血來源的 CD133+ 造血干/祖細胞，只需要 Sox2 和 Oct4 兩個因子即可獲得 iPS 細胞[17]。Kim 等[18]發(fā)現(xiàn)，僅需要兩個轉錄因子 Oct4 和 Klf4 就足以誘導成年小鼠神經(jīng)干細胞獲得 iPS 細胞。此外，George Daley 實驗室發(fā)現(xiàn)相比于皮膚細胞生成的 iPS 細胞，利用血細胞生成的 iPS 細胞更容易重新分化為血細胞，iPS 細胞的這種特性被稱為“表觀遺傳記憶”（epigenetic memory）[19]。上述發(fā)現(xiàn)對于高效率獲得 iPS 細胞或者高效誘導 iPS 細胞獲得目的細胞具有重要的指導意義和應用價值。

目前，利用 iPS 分化來源的造血細胞[20]、神經(jīng)細胞[21]、肝細胞[22]、心肌細胞[23]等在動物模型上進行相關疾病的治療也已獲得成功，從而表明其在體內具有良好的多向分化潛能。此外，目前可以通過 iPS 技術將患者的體細胞重編程為 iPS 細胞，用來研究疾病的發(fā)生機制或進行相關藥物的篩 選[24]。iPS 的成功還意味著可以不用卵子或胚胎就能得到與胚胎干細胞系具有相似分化潛能，同時又可能獲得與患者具有相同免疫配型的特異性的多能干細胞系，該項里程碑式的研究將有可能開啟未來個體化治療的發(fā)展之路。日本神戶的科學家已經(jīng)向政府申請開展世界上第一例 iPS 人體試驗——利用患者自身來源的 iPS 細胞治療視網(wǎng)膜疾病，如果治療申請被批準，將是 iPS 細胞技術的世界首例臨床應用。血液系統(tǒng)雖然目前還沒有進入臨床實驗的報道，但其在 iPS 細胞應用方面的優(yōu)勢顯而易見，由于血液細胞產品（紅細胞、血小板）的無細胞核特性，使得 iPS 細胞基因組中一些潛在的危 險因素在分化獲得的目的細胞中降至最低。同時，也使得進行血液患者來源的 iPS 細胞的基因糾正 （gene correction）成為目前較為安全的潛在應用之一[25-26]。

同樣，我國在細胞重編程領域也取得了令人矚目的成就，據(jù)統(tǒng)計，2011 年，中國在細胞重編程和誘導性多能干細胞領域發(fā)表的論文數(shù)量已位居世界第三位。我國中科院動物所周琪、上海交大曾凡一和北京生命科學研究所高紹榮等研究團隊，于 2009 年分別利用 iPS 細胞克隆出小鼠，從而在世界上首次證明了 iPS 細胞的全能性[27-28]。在細胞重編程的機制研究領域，中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院裴端卿等在 Cell Stem Cell 上報道了間質表皮轉換對重編程的發(fā)生是必需的[29]。

而在個體化治療尚未真正啟動之前，目前具有臨床應用價值的一個工作是建立符合臨床應用標準的人 iPS 細胞庫。iPS 細胞儲存計劃是山中伸彌一直倡導的，該計劃于 2012 年 7 月獲得了日本衛(wèi)生部委員會的支持，批準其利用來自日本全國保存的數(shù)千份胎兒臍帶血樣本建立一個細胞系庫。山中伸彌計劃到 2020 年建立一個包含 75 種 iPS 細胞系的標準庫，從而匹配日本 80% 的人口。

之所以將細胞重編程技術視為再生醫(yī)學發(fā)展的基礎和重要突破，是因為它為多能干細胞獲得提供了新的途徑。此前實驗室研究的干細胞主要來源為胚胎干細胞和成體干細胞，前者雖具有多向分化潛能，但因倫理、技術、資源、免疫、致瘤等問題使其研究和應用受到限制；而后者雖然較易獲得，但其分化效率、組織整合等并不理想。綜合而言，誘導性多能干細胞則集合了兩者的優(yōu)點，淡化了兩者的缺點：來源為成熟細胞，獲得相對廣泛、數(shù)量充足；通過細胞重編程，可使其獲得多向分化潛能；可以來源于患者自體，因此免除了倫理和免疫排斥等問題的困擾。

總之，iPS 細胞在其誕生的短短 6 個年頭里，發(fā)展勢頭迅猛，雖然目前在應用的道路上還存在著眾多問題，但來自不同國家的眾多科學家們在快速而有效地解決著一個又一個束縛其潛在臨床應用的問題，為其在不久的將來進行臨床實驗乃至臨床應用奠定了堅實的科學基礎，體細胞重編程諾貝爾獎的授予必將進一步加快這種應用基礎研究的步伐。

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