童巧文 朱英標(biāo) 鄭榮遠(yuǎn)

咪唑啉2受體配體對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠行為學(xué)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9的影響

童巧文 朱英標(biāo) 鄭榮遠(yuǎn)

目的 觀察咪唑啉2受體配體（2BFI）對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠的行為、病理和腦脊髓中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)的影響。 方法 用髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）免疫C57BL/6小鼠制作EAE模型，將小鼠隨機(jī)分為5組：藥物干預(yù)組（EAE+2BFI 5 mg·kg-1組、EAE+2BFI 10 mg·kg-1組、EAE+2BFI 20 mg·kg-1組）、陽性對照組（EAE+NS組）、正常對照組（完全福氏佐劑+NS組），觀察比較各組行為學(xué)和病理組織學(xué)的變化，通過RT-PCR技術(shù)測定大腦和脊髓MMP-9 mRNA水平，并用免疫組化方法觀測2BFI對大腦組織MMP-9陽性表達(dá)的影響。 結(jié)果 與EAE+NS組比，2BFI 10、20 mg·kg-1藥物干預(yù)組的最高行為學(xué)評分和病理變化均有減輕；而且三種不同劑量2BFI干預(yù)組大腦和脊髓組織MMP-9mRNA水平和大腦組織中MMP-9陽性表達(dá)均較EAE+NS組明顯降低。結(jié)論 2BFI對EAE有保護(hù)作用，可能與其調(diào)節(jié)抑制MMP-9，保護(hù)血腦屏障，減少炎癥細(xì)胞通過血腦屏障有關(guān)。

咪唑啉2受體配體 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

既往眾多研究表明咪唑啉2受體（I2R）與抑郁癥、帕金森病、亨廷頓病、阿片成癮及阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生有關(guān)[1-2]。咪唑啉受體拮抗劑咪唑克生（idazoxan，Ida）能減輕大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的行為學(xué)及病理變化，能明顯減少EAE大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）內(nèi)炎癥因子的表達(dá)[3]。Ida主要與I2R結(jié)合,但同時(shí)也具有α2-受體拮抗作用和較弱的5-HT1A受體激動效應(yīng)。較之Ida，2BFI是一種高選擇性I2R配體，對I2R的結(jié)合具有高選擇性（Ki=1.71nM），在兔腦中能夠特異性結(jié)合高于90%的I2R結(jié)合位點(diǎn)。所以2BFI能夠更好地論證I2R的生物學(xué)功能，目前被廣泛用于I2R的相關(guān)研究[4-5]。本部分實(shí)驗(yàn)通過采用2BFI對EAE小鼠進(jìn)行干預(yù)，并進(jìn)一步觀察2BFI對EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中金屬蛋白酶表達(dá)的影響，以初步觀察2BFI對EAE的作用及探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和試劑 C57BL/6小鼠40只，雌性，8～10周齡，體重18～20g，由北京軍事動物研究所提供，MOG 35～55多肽（西安美聯(lián)多肽技術(shù)公司），完全福氏佐劑（CFA）、百日咳毒素（PT，美國Sigma公司）；結(jié)核分支桿菌菌素（H37Ra，美國Difco公司）；2BFI（英國Tocris公司）。

1.2 EAE模型建立方法 用0.01mol/L的PBS將MOG 35～55稀釋為200～250μg/ml，然后將稀釋液與等量的CFA（結(jié)核桿菌的終濃度為3mg/ml）充分混合，通過三通管將乳劑抽打?yàn)橛桶疇顟B(tài)，即為誘導(dǎo)EAE的抗原乳劑。EAE組小鼠于背部兩側(cè)皮下注射抗原乳劑（內(nèi)含MOG 35～55抗原250μg/只）。對照組不予抗原處理。免疫后即刻及48h給予全部小鼠（包括對照組）腹腔注射PT，每只動物500ng/0.2ml。

1.3 動物分組 按照分層隨機(jī)法編入以下5組：（1）CFA+0.9%氯化鈉溶液（NS）組（8只）：將CFA代替MOG免疫小鼠，并于即刻及48h腹腔注射PT，免疫當(dāng)天開始給0.1ml，腹腔注射，2次/d，共14d。（2）EAE+NS組（8只）：按上述方法免疫小鼠建立模型，免疫當(dāng)天開始給NS 0.1ml，腹腔注射，2次/d，共14d。（3）EAE+2BFI 5mg·kg-1組（8只）：同前方法免疫小鼠建立模型，免疫當(dāng)天開始給2BFI 5mg·kg-1，腹腔注射，2次/d，共14d。（4）EAE+ 2BFI 10 mg·kg-1組（8只）：同前方法免疫小鼠建立模型，免疫當(dāng)天開始給2BFI 10mg·kg-1，腹腔注射,2次/d，共14d。（5）EAE+2BFI 20 mg·kg-1組（8只）：同前方法免疫小鼠建立模型，免疫當(dāng)天開始給2BFI 20mg·kg-1，腹腔注射，2次/d，共14d。

1.4 體重檢測及行為學(xué)評價(jià) 免疫當(dāng)天起每天對小鼠稱重，連續(xù)觀察至小鼠發(fā)病高峰期，采用雙盲法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，并按Weaver15分評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[6]。

1.5 組織取材與病理學(xué)檢查 發(fā)病小鼠于發(fā)病高峰期處死取材，CFA+NS組全部于20d處死。取出大腦和腰髓石蠟包埋后切片，厚度5μm，取大腦視交叉層面、腰髓層面進(jìn)行HE染色并參照Okuda[7]的病理分度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)評分。0：沒有炎癥變化；1：炎癥細(xì)胞浸潤僅限于血管周圍和脊膜周圍；2：脊髓內(nèi)輕微的炎癥細(xì)胞浸潤（1～10個(gè)細(xì)胞/片子）；3：脊髓內(nèi)中度的炎癥細(xì)胞浸潤（11～100個(gè)細(xì)胞/片子）；4：脊髓內(nèi)嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤（＞100個(gè)細(xì)胞/片子）。

1.6 免疫組化測定MMP-9表達(dá) 取腦組織固定、包埋、切片，裱于多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上。參考SP法說明書進(jìn)行免疫組化染色，所有操作均嚴(yán)格遵循說明書。同時(shí)設(shè)陰性對照片，用PBS代替一抗，余步驟相同。棕黃色為陽性染色,無著色為陰性。

1.7 RT-PCR檢測MMP-9mRNA 取50～100mg脊髓，根據(jù)Trizol reagent（Invitrogen）的說明一步法抽提總RNA。提取得到的RNA溶于20ml的1‰焦磷酸二乙酯（diethylpyrocar bonate，DEPC）水，取5ml稀釋20倍。RNA提取后根據(jù)RT-PCR試劑盒（TaKaRa）的說明合成cDNA。PCR引物通過查找Pubmed基因庫內(nèi)相應(yīng)基因的參考序列，應(yīng)用primer primier 5.0自行設(shè)計(jì)，由上海生工合成。MMP-9參考序列號為NM0135 99，順義鏈為5′-CTACTCTGAAGACTTGCCG-3′，反義鏈5′-CCATACAGTTTATC CTGGTC-3′，601 bp。β-肌動蛋白（β-actin）參考序列為NM 007393，順義鏈為5′-AGGGAGACCAAAGCCTTCAT-3′，反義鏈為5′-CCCACTCCTAAG AGGATG-3′，214 bp；取順義和反義引物各200ng和1或2ml的cDNA按照RT-PCR試劑盒說明組成20ml的PCR反應(yīng)體系，94℃預(yù)擴(kuò)增5min后，進(jìn)入循環(huán)體系，MMP-9的擴(kuò)增條件為，94℃30s→58℃30s→72℃1min，34個(gè)循環(huán)；β-actin的擴(kuò)增條件為，94℃30s→55℃30s→72℃1min，32個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物5ml用1.5%的瓊脂糖凝膠（EB 0.5mg·ml-1）電泳，用Gel Documentaion system（BiosensSC6200）凝膠成像系統(tǒng)和Gel-Pro 3.2分析結(jié)果，以目的基因與β-actin的灰度Volume之比作為反映目的基因mRNA水平的相對指標(biāo)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用表示，多組比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；兩組比較用t檢驗(yàn)；率的比較用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病情況 小鼠于免疫后第13天左右開始發(fā)病，先出現(xiàn)精神萎靡,體重下降，尾部張力消失，尾巴拖地不能抬起，繼而后肢無力、步態(tài)異常、癱瘓，一般于17d左右達(dá)到高峰期。與EAE+NS組相比，EAE+2BFI各干預(yù)組在發(fā)病率、潛伏期、高峰期均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但EAE+2BFI 10 mg·kg-1和20mg·kg-1組神經(jīng)癥狀評分較EAE+NS組減輕（均P＜0.01），3個(gè)EAE+2BFI干預(yù)組病理評分較EAE+NS組減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），具有保護(hù)EAE的作用；2BFI干預(yù)對EAE發(fā)病率有減低趨勢（表1）。

2.2 病理學(xué)改變 HE染色：CFA+NS組大鼠的腦及脊髓的病理檢查未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。EAE+NS組的腦、脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)小血管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主，典型者呈血管袖套樣改變。脊髓處更為明顯。3個(gè)2BFI干預(yù)組炎癥浸潤程度均比EAE+ NS組輕，其中以EAE+2BFI 10 mg·kg-1和20 mg·kg-1組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）（表1）。

2.3 免疫組化結(jié)果 MMP-9在EAE小鼠腦內(nèi)有大量表達(dá)，典型的MMP-9陽性細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)濃染的棕黃色顆粒，陽性細(xì)胞主要表達(dá)在脊膜細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)（圖1～5）。EAE+2BFI 5、10、20 mg· kg-1組CNS中MMP-9表達(dá)明顯減少，MMP-9在空白對照組小鼠大腦中表達(dá)不明顯。

表1 各組動物發(fā)病情況、神經(jīng)功能評分和病理評分的比較

圖1 CFA對照組大腦，未見MMP-9陽性表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖3 EAE+2BFI 5 mg· kg-1組大腦，可見MMP-9陽性細(xì)胞的表達(dá),與EAE組相比其表達(dá)減少（免疫組化染色，×400）

2.4 RT-PCR結(jié)果 大腦和脊髓MMP-9 mRNA的表達(dá)，可見EAE+2BFI 5、10、20 mg·kg-1干預(yù)組較EAE+NS組明顯減少（均P＜0.01），其中EAE+2BFI 10、20mg·kg-1與EAE+2BFI 5 mg·kg-1比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），說明前兩組對MMP-9降低作用更為明顯（表2、圖6）。

表2 2BFI對EAE小鼠腦和脊髓MMP-9 m RNA表達(dá)的影響

圖6 各組中樞系統(tǒng)MMP-9mRNA的表達(dá)電泳圖

圖 4 EAE+2BFI 10 mg· kg-1組大腦，可見MMP-9陽性細(xì)胞的表達(dá),與EAE組相比其表達(dá)減少（免疫組化染色，×400）

圖 5 EAE+2BFI 20 mg· kg-1組大腦，可見MMP-9陽性細(xì)胞的表達(dá),與EAE組相比其表達(dá)減少（免疫組化染色，×400）

3 討論

目前認(rèn)為多發(fā)性硬化及其動物模型是以T細(xì)胞介導(dǎo)為主的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)單核細(xì)胞浸潤、白質(zhì)脫髓鞘和軸索損傷為特征的自身免疫反應(yīng)性疾病。其中血腦屏障（BBB）的破壞導(dǎo)致炎癥細(xì)胞侵入CNS的過程是EAE發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。

MMP-9又稱明膠酶B，其主要降解明膠、Ⅳ、Ⅴ型膠原、彈性蛋白等，參與了MS的局灶性血腦屏障損害、淋巴細(xì)胞募集、血管周圍炎癥浸潤等病理損害。體外實(shí)驗(yàn)表明MMP-9通過降解血管內(nèi)皮細(xì)胞中的基質(zhì)蛋白而增加微血管通透性，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞穿透BBB[8]。Kieseier等[9]發(fā)現(xiàn)在EAE大鼠模型中MMP-9mRNA水平較正常組明顯增高，MMP-9達(dá)峰值與疾病嚴(yán)重程度一致，明膠酶譜法亦證明MMP-9的蛋白水解活性增加。無論在EAE小鼠還是MS患者CFS中均發(fā)現(xiàn)MMP-9蛋白表達(dá)增加，并且與病情相關(guān)[10-11]。Dubois等[12]發(fā)現(xiàn)＜4周齡的MMP-9敲除小鼠相對于正常小鼠對EAE的易感性降低，平均臨床評分明顯減少，但是上述現(xiàn)象在成年鼠實(shí)驗(yàn)中并不明顯。以上研究均提示MMP-9對EAE或MS的發(fā)病有著重要作用。本實(shí)驗(yàn)免疫組化顯示EAE+ NS組小鼠腦組織內(nèi)MMP-9陽性細(xì)胞的表達(dá)增多，而CFA+NS對照組未見MMP-9陽性表達(dá)，此結(jié)果與上述觀點(diǎn)一致。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用2BFI來干預(yù)EAE，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EAE+ 2BFI 10、20mg·kg-1干預(yù)組小鼠臨床評分和病理學(xué)評分均明顯低于EAE+NS組大鼠。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)的免疫組化染色和RT-PCR檢測結(jié)果，3個(gè)不同劑量2BFI干預(yù)組小鼠腦脊髓MMP-9的表達(dá)明顯低于EAE陽性對照組，其中以EAE+2BFI 10、20mg·kg-1兩組更為明顯。故EAE+2BFI組中對MMP-9的抑制在宏觀水平、蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平均有體現(xiàn)。提示2BFI能夠抑制EAE的發(fā)病，減輕發(fā)病小鼠的臨床癥狀。這可能是由于2BFI的作用使得星形膠質(zhì)細(xì)胞的增值活化作用，并減少其氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)EAE恢復(fù)。在既往的研究已經(jīng)報(bào)道咪唑啉配體能增加星形膠質(zhì)細(xì)胞上GFAP標(biāo)志蛋白的表達(dá)，并促進(jìn)其活化增殖[13-14]。Pagenstecher等[15]發(fā)現(xiàn)在EAE中，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞能產(chǎn)生多種TIMPs（金屬蛋白酶組織抑制劑），導(dǎo)致MMP-9降低。因此2BFI可能同時(shí)參與調(diào)節(jié)EAE中MMPs和TIMPs的失衡。

綜上所述，2BFI作為咪唑啉受體配體對EAE具有保護(hù)作用，減輕臨床癥狀和病理組織學(xué)損傷程度，降低EAE小鼠MMP-9的表達(dá)。因此，可以將咪唑啉受體的應(yīng)用作為一種治療EAE或MS的新思路，進(jìn)一步研究和探索其保護(hù)機(jī)制。

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Effect of 2BFI on behavior and MMP-9 expression in experimental autoimmune encephalomyelitis mice

2BFIExperimental autoimmune encephalomyelitisrats(EAE)Matrix metalloproteinase-9(MMP-9)

2012-05-14）

（本文編輯：沈昱平）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81070960）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2090923）

325000 溫州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（童巧文）；麗水市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（朱英標(biāo)）；溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（鄭榮遠(yuǎn)）

鄭榮遠(yuǎn)，E-mail:zhengry@yahoo.com.cn

【 Abstract】Objective To investigate the effect of 2BFI on the behavior and MMP-9 expression in experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)mice,Methods C57B/L mice were immunized with myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG)to establish the mice model of EAE.The mice were randomly divided into 5 groups：EAE+2BFI groups(2BFI 5 mg·kg-1,10 mg·kg-1and 20 mg·kg-1),EAE+NS group and CFA+NS group.After immunization,the mice in EAE+2BFI groups were treated with intraperitoneal injection of 2BFI 5 mg·kg-1,10 mg·kg-1and 20 mg·kg-1,respectively;whereas the mice in EAE+NS and CFA+NS groups were treated with an intraperitoneal injection of 0.1ml normal saline.The immunohistochemical staining was used to detect the expression of MMP-9 protein and RT-PCR was used to determine MMP-9 mRNA expression.Results In 2BFI 10 and 20 mg·kg-1groups,the maximum clinical scores and pathological change were both decreased.Compare with EAE+NS Group,the expression of MMP-9 protein and mRNA in the brain of EAE mice was decreased in three EAE+2BFI groups.Conclusion 2BFI can protect mice from EAE,which is associated with reduced MMP-9 expression in central nervous system.