劉艷 熊丹 張小潔 錢聰 信照亮

●論 著

SAH后下丘腦中5-羥色胺、去甲腎上腺素水平改變及地塞米松的作用

劉艷 熊丹 張小潔 錢聰 信照亮

目的 觀察大鼠實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）后下丘腦組織勻漿5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（Noradrenaline，NA）水平隨時(shí)間變化情況，以及地塞米松（dexamethasone，DXM）不同給藥途徑對(duì)兩者水平的影響。 方法 實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、SAH組、腹腔給藥組和腦池內(nèi)給藥組，按時(shí)間分為3、7、14、21d 4個(gè)亞組，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定下丘腦組織中5-HT和NA的含量。 結(jié)果 5-HT水平在SAH后3d開始上升，7d達(dá)到高峰，14d仍維持在較高水平，21d下降到接近3d時(shí)的水平；NA的水平從第3天開始上升，第7、14、21天，水平呈逐漸升高的改變，與5-HT變化的時(shí)間模式不一致。DXM治療組中5-HT水平均較SAH組明顯降低（均P＜0.05），且兩種用藥途徑間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；DXM治療對(duì)NA水平影響不大（P＞0.05）。 結(jié)論 SAH發(fā)生后，可導(dǎo)致下丘腦組織中5-HT和NA水平升高，可能與SAH后睡眠/覺醒異常的發(fā)生相關(guān)，但兩者變化的時(shí)間模式不同。DXM可降低SAH后下丘腦組織中5-HT水平，可能是其促進(jìn)清醒的機(jī)制之一。DXM腦池內(nèi)給藥是一種可選擇的用藥途徑。

蛛網(wǎng)膜下腔出血 5-羥色胺 去甲腎上腺素 地塞米松

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是神經(jīng)內(nèi)、外科的常見疾病。對(duì)SAH后蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)發(fā)生的炎癥以及遲發(fā)性腦缺血的機(jī)制研究很多[1]，而對(duì)SAH后的腦組織改變和對(duì)腦功能的影響，研究較少[2]。單胺類遞質(zhì)在睡眠/覺醒中具有重要作用[3]。SAH發(fā)生后，是否會(huì)引起腦組織中單胺遞質(zhì)水平的變化，從而導(dǎo)致睡眠/覺醒的異常變化，研究報(bào)道不多，且觀察的時(shí)間多限于48h內(nèi)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松（DXM）蛛網(wǎng)膜下腔（腦池內(nèi)）應(yīng)用，能夠減輕腦血管痙攣[5]，是否具有促清醒作用及其機(jī)制，未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將探討SAH后下丘腦組織中5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（Noradrenaline，NA）水平變化模式以及DXM不同用藥途徑對(duì)兩者水平的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 52只健康清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重250g左右，浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用數(shù)字表分組法隨機(jī)分為：空白對(duì)照組（4只）、SAH組（制模后3、7、14、21d各4只）、腦池內(nèi)給藥組（制模后3、7、14、21d各4只）、腹腔給藥組（制模后3、7、14、21d各4只）。在上述預(yù)定的時(shí)間進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。各組中動(dòng)物如有死亡則予以補(bǔ)充。

1.2 動(dòng)物模型的建立 SAH組：采用10%水合氯醛0.35ml/100g腹腔內(nèi)注射麻醉后，大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，常規(guī)消毒鋪巾后，分離一側(cè)股動(dòng)脈，插入套管針留置備用。之后翻轉(zhuǎn)大鼠，俯臥頭低位固定，正中切開暴露寰枕筋膜，用特殊制備的穿刺針進(jìn)行穿刺，成功后先回抽腦脊液0.2ml，然后取股動(dòng)脈血0.2ml緩慢經(jīng)穿刺針注入枕大池。拔針后以醫(yī)用EC膠封閉硬腦膜穿刺孔，并保持頭低位0.5h?？p合切口，待麻醉復(fù)蘇后送回籠中喂養(yǎng)。48h后再次打開寰枕筋膜，枕大池穿刺，注動(dòng)脈血0.2ml，拔針后再次以醫(yī)用EC膠封閉硬腦膜穿刺孔，保持頭低位0.5h，縫合切口，完成兩次注血SAH模型的制作。

腹腔給藥組：SAH模型制作結(jié)束，15min后腹腔給予DXM 1 mg/100g大鼠體重。

腦池內(nèi)給藥組：SAH模型二次注血后，先不拔出穿刺針，15min后注入DXM 0.1mg/100g大鼠體重，給藥完成后再封閉穿刺點(diǎn)。

空白對(duì)照組：0.2ml 0.9%氯化鈉溶液代替0.2ml動(dòng)脈血，步驟同SAH組。

1.3 標(biāo)本采集及檢測(cè) 分別于模型二次注血后3、7、14、21d，大鼠麻醉后，磷酸鹽緩沖液左心室灌注，并剪開右心耳，待流出液變白后，斷頭，快速取出下丘腦。將取出的腦組織放入含有100μM Na2-EDTA和100ng/ml異丙醇/高氯酸的勻漿器中，冰上勻漿20s；勻漿15 000 g離心30min；上清液用1M乙酸鈉溶液調(diào)整pH值在3左右；將上清液使用0.45μm的濾膜過(guò)濾，用餾分收集器收集過(guò)濾液，用高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)NA和5-HT的水平。HPLC使用反向色譜柱（ODS-80 4.6mm i.d. ×15cm）和電化學(xué)檢測(cè)儀（Model ECD-100,Eikom Co.,日本），用含有5mg/L Na2-EDTA,15%甲醇，200mg/L辛烷磺酸鈉的乙酸鈉-檸檬酸緩沖液洗脫色譜柱[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SAH后下丘腦組織勻漿各組不同時(shí)間點(diǎn)5-HT水平的改變 見表1。

表1 SAH后下丘腦組織勻漿各組不同時(shí)間點(diǎn)5-HT水平（ng/g腦組織）

由表1可見，SAH組在3、7、14、21d下丘腦5-HT水平均較空白對(duì)照組明顯升高（均P＜0.01）；腹腔給藥組在3、7、14、21d下丘腦5-HT水平均較SAH組明顯降低（均P＜0.01）；腦池內(nèi)給藥組應(yīng)用DXM組3d下丘腦5-HT水平較SAH組明顯降低（P＜0.01），7d下丘腦5-HT水平較SAH組降低（P＜0.05）。

2.2 SAH后下丘腦組織勻漿各組不同時(shí)間點(diǎn)NA水平的改變 見表2。

表2 SAH后下丘腦組織勻漿各組不同時(shí)間點(diǎn)NA水平（ng/g腦組織）

由表2可見，SAH組在7、14、21d下丘腦NA水平均較空白對(duì)照組升高（均P＜0.05）；腹腔給藥組、腦池內(nèi)給藥組下丘腦NA水平與SAH組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

睡眠/覺醒的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括眾多的神經(jīng)核團(tuán)和遞質(zhì),彼此間形成相互制約的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),同時(shí)也與內(nèi)穩(wěn)態(tài)和生物節(jié)律的影響有關(guān)[7]。一般認(rèn)為，視前區(qū)-下丘腦前部與睡眠相關(guān)，下丘腦后部與覺醒相關(guān)，且睡眠中樞與喚醒中樞處于交互抑制狀態(tài)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦結(jié)節(jié)乳頭狀核和腹外側(cè)視前區(qū)是兩個(gè)重要的與睡眠/覺醒相關(guān)的區(qū)域。因此本研究選擇下丘腦作為觀察的部位。5-HT是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，除與抑郁癥、焦慮癥、強(qiáng)迫癥、認(rèn)知和疼痛等密切相關(guān)外，5-HT可通過(guò)激動(dòng)不同的受體亞型發(fā)揮與睡眠/覺醒調(diào)節(jié)相關(guān)的作用，激動(dòng)突觸前5-HT1A受體可延長(zhǎng)非快速眼動(dòng)睡眠（NREMS）并減少覺醒；激動(dòng)突觸后5-HT1A受體可抑制快速眼球運(yùn)動(dòng)睡眠（REMS）和促進(jìn)覺醒；拮抗5-HT2受體可促進(jìn)NREMS，抑制REMS，促進(jìn)覺醒[9-13]。NA也是一種神經(jīng)遞質(zhì)，在NREMS期緩慢釋放，在REMS期則完全靜止?？梢姡?-HT與NA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，在維持睡眠/覺醒中可能相互協(xié)同發(fā)揮作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，腦卒中發(fā)生后，單胺類遞質(zhì)在各腦區(qū)有著不同的變化情況，選擇的部位和時(shí)間不同結(jié)果也各不盡相同。劉國(guó)軍等[4]用高效液相色譜儀，觀察對(duì)比正常鼠與大腦中動(dòng)脈栓塞24h后大鼠腦干各區(qū)的NA、多巴胺與5-HT含量的變化，在栓塞24h時(shí)5-HT明顯高于正常組，并據(jù)此認(rèn)為，多遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)失衡與卒中后睡眠/覺醒障礙的發(fā)生有關(guān)。

SAH后最常見嚴(yán)重的并發(fā)癥是遲發(fā)性腦缺血，一般在3d出現(xiàn)，7d最為嚴(yán)重，14d后開始下降，21d后恢復(fù)。有學(xué)者用熒光分光光度法檢測(cè)了大鼠SAH后48h腦皮質(zhì)中NA、5-HT和5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）的水平，發(fā)現(xiàn)SAH引起腦皮質(zhì)NA、5-HT和5-HIAA的明顯升高。分腦區(qū)研究發(fā)現(xiàn)，SAH后NA的升高僅見于腦皮質(zhì)，腦干、小腦等，其他腦區(qū)則無(wú)明顯變化（未測(cè)定下丘腦區(qū)）。5-HT與NA均不易通過(guò)血腦屏障，這提示SAH后腦皮質(zhì)內(nèi)5-HT和NA水平的升高主要與腦內(nèi)的合成增加有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦5-HT水平在SAH后3d開始上升，7d達(dá)到高峰，14d仍維持在較高水平，21d下降到接近3d時(shí)的水平，與SAH后的最主要的并發(fā)癥遲發(fā)性腦缺血的發(fā)生時(shí)間模式一致（但兩者之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制有待證實(shí)）。而下丘腦NA的水平，從第3天開始上升，第7、14、21天水平呈逐漸升高的改變，與5-HT水平變化的時(shí)間模式不一致。5-HT和NA之間的變化關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

糖皮質(zhì)激素受體（GR）廣泛分布于腦組織。一般認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素（GC）主要是通過(guò)與GR結(jié)合后，上調(diào)抗炎基因和（或）下調(diào)抑炎癥基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)其抗炎作用。DXM是臨床上最常用的GC之一，通過(guò)穩(wěn)定溶酶體膜，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生、巨噬細(xì)胞移行和致炎物質(zhì)緩激肽和前列腺素的釋放等發(fā)揮作用，還能抑制5-HT產(chǎn)生的作用。GC通過(guò)經(jīng)典受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用需要一定時(shí)間，包括GC透過(guò)細(xì)胞膜到誘導(dǎo)或抑制相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，至少需要30min，蛋白水平變化再引起有治療意義的變化，需要數(shù)小時(shí)到數(shù)天時(shí)間；GC也可以通過(guò)調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子信號(hào)在幾分鐘內(nèi)就發(fā)揮快速的作用，而發(fā)揮這種非受體依賴機(jī)制需要的劑量，必須超過(guò)與體內(nèi)儲(chǔ)備GR結(jié)合所需的激素量，這是大劑量沖擊治療的可能機(jī)制。不良反應(yīng)多發(fā)生在大劑量應(yīng)用時(shí)，因此探討不同給藥途徑的效果以減輕不良反應(yīng)是一種選擇。

有實(shí)驗(yàn)證明，DXM腦池內(nèi)注射對(duì)保護(hù)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞作用顯著，并減輕腦水腫，預(yù)防蛛網(wǎng)膜粘連和腦積水發(fā)生[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腦池內(nèi)小劑量注射與腹腔大劑量全身應(yīng)用，均能降低下丘腦5-HT水平，這可能與DXM的促清醒作用相關(guān)，因兩種用藥途徑的作用差異不甚明顯，腦池內(nèi)小劑量應(yīng)用可能是一種較好選擇。DXM影響5-HT水平的機(jī)制，除可能通過(guò)作用于GR抑制5-HT的產(chǎn)生有關(guān)外，也可能通過(guò)抑制SAH后蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)的炎癥和免疫反應(yīng)，改善遲發(fā)性腦缺血有關(guān)。

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（本文編輯：田云鵬）

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（收稿日期：2012-06-18）

（本文編輯：沈昱平）

Levels of 5-hydroxytryptamine and noradrenaline in rat hypothalamus after subarachnoid hemorrhage and effects of dexamethasone

Objective To investigate the levels of 5-hydroxytryptamine(5-HT)and norepinephrine(NA)in rat hypothalamus after subarachnoid hemorrhage(SAH),and the effect of dexamethasone(DXM)on 5-HT and NA.Methods The rats were randomly divided into 4 groups:the blank,SAH control,SAH treated by intracisternal DXM and SAH treated with intraperitoneal DXM.The levels of 5-HT and NA were measured by high performance liquid chromatograph.Results The 5-HT in hypothalamus tissue began to rise in 3d,reached to peak in 7d,remained at high level in 14d and went down to d3 level in 21d,which was consistent with the timing of delayed cerebral ischemic.The NA in hypothalamus tissue began to rise in 3d and kept rising in 7, 14 and 21d,which was not consistent with the mode of 5-HT.The levels of 5-HT were decreased after DXM treatment and there was no significant difference between intracisternal and intraperitoneal administration.There were no changes of NA levels after DXM treatment.Conclusion 5-HT and NA levels in hypothalamus are increased after SAH,which may be involved in abnormality of sleep/wakefulness,but the time modes of 5-HT and NA are different.DXM may promote wakefulness by lowering 5-HT level in hypothalamus after SAH,and DXM can be administrated intracisternally as an alternative way.

Suharachnold hemorrhage 5-hydroxytryptamine Noradrenaline Dexamethasone

2012-11-22）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30370497）；浙江省社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（2007C33039）

325035 溫州醫(yī)學(xué)院（劉艷、熊丹、張小潔）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院神經(jīng)外科（錢聰）；溫州醫(yī)學(xué)院、浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校（信照亮）

信照亮，E-mail:wxk555@sohu.com