金 純，鄒章勇，程 溥，劉 樂，郭貴龍

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江溫州325000)

甲狀腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居頭頸部腫瘤之首。大部分甲狀腺癌患者都能獲得良好預(yù)后，但有一小部病例會出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)，預(yù)后差［1］。為了解甲狀腺癌復(fù)發(fā)與BRAF基因突變的關(guān)系，我們檢測了2004年8月～2012年2月收治的20例復(fù)發(fā)甲狀腺癌患者原發(fā)灶、復(fù)發(fā)灶及20例無復(fù)發(fā)甲狀腺癌患者腫瘤組織中BRAF基因T1799A位點的V600E突變情況?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2004年8月～2012年2月收治的20例復(fù)發(fā)甲狀腺乳頭狀癌患者，為復(fù)發(fā)組。其中男6例、女14例，平均年齡48.4歲(21～79歲)。取其原發(fā)癌組織和復(fù)發(fā)癌組織蠟塊標(biāo)本。另隨機選取2004～2006年于我院接受手術(shù)、隨訪至2013年1月1日無復(fù)發(fā)生存的20例甲狀腺乳頭狀癌患者為無復(fù)發(fā)組，亦取其腫瘤組織蠟塊。所有病例均無術(shù)前治療史，無頭頸部腫瘤病史，無重大內(nèi)科疾病史。1.2 BRAF基因T1799A位點突變檢測 將上述蠟塊送蘇州生物醫(yī)藥公司純化并用聚合酶鏈反應(yīng)擴增后直接測序，所得結(jié)果與BRAF基因組DNA正常序列對比以確定有無點突變。

1.2.1 DNA的提取 將上述所取的蠟塊標(biāo)本碾碎，提取DNA，提取的DNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增目標(biāo)片段 設(shè)計引物，引物由蘇州生物醫(yī)藥公司合成，引物序列如下:正向引物5'-TCATAATGCTTGC-TCTGATAGGA-3'，反向引物 5'-GGCCAAAAAT-TTAATCAGTGGA-3'，擴增后目標(biāo)片段長度為224 bp。PCR反應(yīng)體系為:雙蒸水17.8μL，10×擴增緩沖液(含Mg2+)2.5μL，正反向引物各0.5 μL(20 μmol/L)，DNA 模板1.5 μL，Tap DNA 聚合酶0.2 μL(5 U/μL)，dNTP 2.0 μL(10 mmol/L)，總體積25μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，59.2 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，共 35個循環(huán);繼以72℃延伸8 min后結(jié)束。

1.2.3 電泳檢測PCR產(chǎn)物 為明確PCR產(chǎn)物中有目標(biāo)DNA片段，取PCR產(chǎn)物5μL與DNA加樣緩沖液1.0μL混合后加樣，以DNA標(biāo)記物1.0μL作為分子對照，在6%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳并行AgNO3染色。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的測序 將經(jīng)電泳證實的PCR產(chǎn)物送蘇州生物醫(yī)藥公司純化并測序，所得結(jié)果與BRAF基因組DNA正常序列對比以確定有無點突變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。兩樣本表達(dá)陽性率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

復(fù)發(fā)組原發(fā)灶BRAF基因T1799A位點V600E突變率為55%(11/20)，其中男4例、女7例，復(fù)發(fā)病灶突變率為50%(10/20)，其中男4例、女6例;1例原發(fā)灶BRAF基因為突變型，而復(fù)發(fā)灶為野生型。無復(fù)發(fā)組BRAF基因T1799A位點V600E突變率為25%(5/20)。復(fù)發(fā)組BRAF突變率高于無復(fù)發(fā)組(P 均 ＜0.05)。

3 討論

已有研究顯示，甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多步驟的過程。80%的基因突變發(fā)生在RET/PTC-RAS-RAF-MARK途徑中，其中 BRAF基因的突變率最高，約44%［2］。研究還發(fā)現(xiàn)，BRAF突變型甲狀腺乳頭狀癌的組織侵襲力強［3］，容易浸潤甲狀腺周圍組織，臨床分期晚［4］。

研究表明，BRAF基因突變是導(dǎo)致MAPK信號通路異常激活的主要原因之一。目前已發(fā)現(xiàn)有超過40種BRAF基因突變類型。最常見的是T1799A位點的V600E變異，占90%以上。BRAF突變是否與腫瘤的惡性行為相關(guān)，目前尚有爭議。而近年Oler等［5，6］的研究顯示BRAF基因突變與碘代謝基因的低表達(dá)存在聯(lián)系，顯示BRAF可能與部分分化型甲狀腺癌放療中的“碘抗拒”有關(guān)［7］。在臨床上，BRAF基因突變與甲狀腺癌的關(guān)系已經(jīng)得到了深入的研究。通過激活MAPK信號通路，BRAF基因V600E點突變有著很強力的致癌作用，如促進(jìn)惡變細(xì)胞包膜外浸潤，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，已經(jīng)得到很多實驗的證實［8，9］。而 Kebebew 等［10］研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌中BRAF基因V600E突變者術(shù)后癌組織殘留和復(fù)發(fā)風(fēng)險高，與本研究的結(jié)果相符。

既往的觀點認(rèn)為，復(fù)發(fā)腫瘤與原發(fā)灶作為單細(xì)胞克隆，分子表型應(yīng)該一致。但在乳腺癌等惡性腫瘤的研究顯示，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病灶雌激素受體表型可能出現(xiàn)變異。這方面研究在甲狀腺癌領(lǐng)域尚屬空白。本研究中1例患者復(fù)發(fā)灶BRAF基因T1799A位點基因型與原發(fā)灶不一致，提示甲狀腺癌復(fù)發(fā)病灶BRAF分子表達(dá)與原發(fā)灶相比也可能存在變異，這有可能為未來復(fù)發(fā)性甲狀腺癌的靶向治療提供參考。

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［5］Oler G，Cerutti JM.High prevalence of BRAF mutation in a Brazilian cohort of patients with sporad ic papillary thyroid carcinomas:correlation with more aggressive phenotype and decreased expression of iodidem etabolizing genes［J］.Cancer，2009，115(5):972-980.

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［10］Kebebew E，Weng J，Bauer J，et al.The prevalence and prognostic value of BRAF mutation in thyroid cancer［J］.Ann Surg，2007，246(3):466-471.