關(guān)棣鍇，胡文忠 ，姜愛麗，薩仁高娃

(1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034;2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連116600)

單核細(xì)胞增多性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)是一種能引起人畜共患的食源性致病菌，其在自然界分布廣泛，對環(huán)境的耐受性強(qiáng)，可造成多種食品的污染，如奶制品、肉制品、水產(chǎn)品、新鮮蔬菜等植物性食品［1］。該菌引發(fā)的人類李斯特菌病致死率高達(dá)30%，尤其對孕婦、新生兒、老年人以及免疫功能缺陷者具有較高的感染風(fēng)險(xiǎn)。近些年，食品污染單核細(xì)胞增多性李斯特菌而導(dǎo)致的食物中毒爆發(fā)事件日見增多。2011 年9 月，美國爆發(fā)的香瓜李斯特菌中毒事件導(dǎo)致全美24 個(gè)州出現(xiàn)李斯特菌感染病例，截止2011 年12 月，30 人確認(rèn)因感染李斯特菌死亡。2008 年8 月，加拿大共發(fā)生57 起李斯特菌感染事件，造成23 人死亡，死者大部分為老年人。2002 年法國一家公司加工生產(chǎn)的部分肉醬和豬舌受到李斯特菌污染，導(dǎo)致9 人感染，2 人死亡［2］。因此，加強(qiáng)對該菌的認(rèn)識(shí)了解，研制出更快、更有效的檢測方法已刻不容緩。

1 單核細(xì)胞增多性李斯特菌的生物學(xué)特性和毒力因子

1.1 生物學(xué)特性

李斯特氏菌屬共有7 個(gè)菌種，即單核細(xì)胞增多性李斯特菌、綿羊李斯特菌(Listeria ivanvii)、英諾克李斯特菌(Listeria innocua)、威爾斯李斯特菌(Listeria welshimeri)、西爾李斯特菌(Listeria seeligeri)、格氏李斯特菌(Listeria grayi)以及默氏李斯特菌(Listeria murrayi)。在這7 個(gè)菌種中只有單核細(xì)胞增多性李斯特菌是人畜共患致病菌，綿羊李斯特菌是動(dòng)物致病菌。單核細(xì)胞增多性李斯特菌為短小的革蘭氏陽性無芽胞兼性厭氧桿菌，長度為1 ～2μm、寬度為0.5μm，有鞭毛。菌落直徑約0.12～0.14mm，在斜射光下呈典型的藍(lán)綠色光澤。在血平板上培養(yǎng)24～96h，菌落呈現(xiàn)β- 溶血。其生長最低溫度有報(bào)道為-0.4℃，菌數(shù)在4℃保持穩(wěn)定，8℃急劇增加，最高生長溫度約為45℃。生長的pH 范圍在5.16～9.18 之間，但在中性或弱堿性條件下生長最好［3］。

1.2 毒力因子

1.2.1 李斯特菌溶血素O(Listeriolysion O，LLO)LLO 是由hly 基因編碼的Hly 蛋白，與破壞吞噬體，促進(jìn)菌體進(jìn)入胞液有關(guān)，是細(xì)菌得以在胞液內(nèi)增殖的先決條件，是李斯特菌的一種基本毒力因子，它的缺失將會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒力的全部喪失。且大多數(shù)PCR都選擇了針對hly 基因進(jìn)行檢測［10-13，22-23］。Aznar等［4］通過比較8 對引物篩選出針對hly 基因的引物，擴(kuò)增出702bp 片段，在72 株菌株(標(biāo)準(zhǔn)菌株和食品分離株)中特異地?cái)U(kuò)增單增李斯特菌的hly 基因，體現(xiàn)出了很強(qiáng)的特異性。

1.2.2 磷脂酶C(phospholipase C，PLC) 單核細(xì)胞增多性李斯特菌能產(chǎn)生兩種磷脂酶C:磷脂酞肌醇磷脂酶C(phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)和磷脂酞膽堿磷脂酶 C (phosphatidylcholin phospholipase C，PC-PLC)。PI-PLC 由plcA 基因編碼，PC-PLC 由plcB 基因編碼。目前有研究認(rèn)為PIPLC 毒性相對較小，對細(xì)菌在細(xì)胞間擴(kuò)散作用不大，可輔助細(xì)菌逸出初級(jí)吞噬體，而細(xì)菌在細(xì)胞與細(xì)胞之間的擴(kuò)散過程中，PC-PLC 則表現(xiàn)出一定的活性作用。也有研究發(fā)現(xiàn)PC-PLC 可介導(dǎo)單核細(xì)胞增多性李斯特菌裂解人上皮細(xì)胞的初級(jí)吞噬體，并且參與細(xì)胞與細(xì)胞之間的擴(kuò)散［5］。

1.2.3 毒力調(diào)節(jié)因子(PrfA 蛋白) PrfA 蛋白由prfA編碼，可激活所有基因簇的轉(zhuǎn)錄，對許多毒力因子的定位表達(dá)起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究表明，可采用prfA 基因設(shè)計(jì)的引物和探針在生牛奶、鮭魚肉、奶酪中特異地檢測出單增李斯特菌［6］。

1.2.4肌動(dòng)蛋白聚集蛋白(act in polymerizing protein，ActA) ActA 蛋白由actA 基因編碼的表面蛋白，通過誘導(dǎo)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白分子的聚合作用促使細(xì)菌在細(xì)胞與細(xì)胞之間的傳遞，同時(shí)也與細(xì)菌被宿主細(xì)胞內(nèi)化有關(guān)［7］。

1.2.5細(xì)胞壁水解酶(invasion associated protein，P60) P60 蛋白是一種胞壁質(zhì)水解酶，分子質(zhì)量為60ku，由iap 基因編碼。有關(guān)缺失iap 基因的研究表明，它對于細(xì)胞的分裂是必不可少的，與該菌的侵襲性有密切關(guān)系。分析P60 蛋白編碼基因的突變體顯示，對于單核細(xì)胞增多性李斯特菌的吞噬細(xì)胞溶解作用以及對機(jī)體的感染過程，P60 蛋白是一個(gè)重要的因素［5］。

此外，還有內(nèi)化素(Internalis，Inl)、表面蛋白104(surface protein 104，SP104)、自溶素(Auto)等幾種毒力因子，這里不再逐一介紹，僅選擇以上幾種主要的毒力因子進(jìn)行介紹。

2 單核細(xì)胞增多性李斯特菌的快速檢測

2.1 分子生物學(xué)方法

2.1.1 核酸探針雜交技術(shù) 核酸探針雜交技術(shù)就是將兩條堿基互補(bǔ)的DNA 鏈在適當(dāng)?shù)臈l件下雜交，通過檢測待測樣品與標(biāo)記性DNA 探針之間形成的雜交分子來判斷樣品中是否存在單核細(xì)胞增多性李斯特菌，測定放射性或熒光強(qiáng)度可以得出樣品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的個(gè)數(shù)，其主要是以單核細(xì)胞增多性李斯特菌特有的毒力基因?yàn)榘谢?。例如，Volokhov 等［8］以李斯特菌屬的六種毒力蛋白基因?yàn)榘谢颍O(shè)計(jì)多對引物進(jìn)行多重PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片中的經(jīng)熒光標(biāo)記的種特異性寡核苷酸探針雜交，將李斯特菌屬檢測到種的水平，且縮短了檢測時(shí)間。也有研究人員根據(jù)16S rRNA 和23S rRNA 基因間的間隔區(qū)序列設(shè)計(jì)PCR 引物，將PCR 產(chǎn)物和單核細(xì)胞增多性李斯特菌的特定寡核苷酸探針進(jìn)行雜交，通過比色法測定雜交體，結(jié)果表明，每25mL 樣品中能檢測出1～10cfu［9］。

2.1.2 常規(guī)PCR 技術(shù) 常規(guī)PCR 技術(shù)已經(jīng)發(fā)展的相當(dāng)成熟，它和體內(nèi)發(fā)生DNA 復(fù)制過程十分相似。其與核酸探針雜交相比可以以微量的樣品得到大量的靶DNA 和靶RNA。單核細(xì)胞增多性李斯特菌基因組上的hly 基因是常用于PCR 技術(shù)中的特異性靶基因。周曉輝等［10］用PCR 擴(kuò)增hly 基因，檢測單核細(xì)胞增多性李斯特菌的純培養(yǎng)物及其模擬污染的生豬肉、水和牛奶。結(jié)果表明所擴(kuò)增的hly 基因3'末段850bp 的DNA 片段對單核細(xì)胞增多性李斯特菌有較高的特異性，PCR 對單核細(xì)胞增多性李斯特菌純培養(yǎng)物的檢測低限達(dá)10cfu·mL-1，對模擬污染生豬肉、水和牛奶的增菌培養(yǎng)液檢測低限均達(dá)到400cfu·kg-1，整個(gè)檢測過程只需24h。研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)單核細(xì)胞增多性李斯特菌的hlyA 基因和李斯特菌屬的l6S rRNA 基因分別設(shè)計(jì)一對引物，將兩對引物組合建立PCR 方法檢測人工污染的食品，檢測限會(huì)更低，達(dá)1cfu/25g［11］。

隨著檢測技術(shù)的不斷深入研究、優(yōu)化，常規(guī)PCR技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合對鮮活農(nóng)產(chǎn)品樣品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌進(jìn)行檢測已屢見不鮮。M N Marian 等［12］采用MPN-PCR 技術(shù)對生鮮和即食食品中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌進(jìn)行檢測，擴(kuò)增16S rRNA 基因的938bp 片段和hlyA 毒力基因的701bp片段，得到94.3%的樣品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的數(shù)量＜100MPN/g。采用PCR-ELISA 方法快速檢測牛奶樣品中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌，與傳統(tǒng)PCR 方法相比，可提高檢測敏感性，約為傳統(tǒng)PCR方法的10～100 倍。此方法以單核細(xì)胞增多性李斯特菌的致病基因hlyA 為基礎(chǔ)，選用PCR 引物，應(yīng)用地高辛標(biāo)記試劑盒，獲得單增李斯特菌特異的地高辛標(biāo)記片段。最低可從25mL 染菌牛奶中檢出1cfu，完成檢查約需6h［13］。而王麗麗等［14］建立的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-核酸層析(PCR-NALF)方法可替代常規(guī)PCR 過程中的電泳從而實(shí)現(xiàn)更便捷的單核細(xì)胞增多性李斯特菌檢測。其通過一對標(biāo)記生物素和地高辛的引物，對提取自樣品中的DNA 進(jìn)行擴(kuò)增，然后用包被親和素和抗地高辛抗體的層析試紙條對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，并通過肉眼可見的紅色條帶進(jìn)行結(jié)果判讀。在特異性實(shí)驗(yàn)中，其他李斯特菌和常見致病菌均呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，與電泳結(jié)果一致。

2.1.3 多重PCR 技術(shù) 多重PCR(MPCR)也稱復(fù)合PCR，主要有兩種形式:將多條引物和多個(gè)模板DNA混合在同一個(gè)反應(yīng)體系中分別特異擴(kuò)增不同的目的條帶;將多條引物和單一的模板DNA 混合在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增同一模板的不同片段。具有快捷方便、高效、經(jīng)濟(jì)簡便等優(yōu)點(diǎn)。

徐偉等［15］根據(jù)單增李斯特菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因prfA、志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖璈 基因ipaH 篩選出引物，優(yōu)化多重PCR 條件，分析單一PCR 及多重PCR 的特異性、靈敏度，且確定多重PCR 檢測人工污染脫脂滅菌乳的檢出限。結(jié)果為多重PCR 擴(kuò)增出預(yù)計(jì)的PCR 產(chǎn)物，其中單增李斯特菌檢測低限為78pg，人工污染脫脂滅菌乳中檢測低限為2cfu/25mL。也有利用大腸桿菌GADA/B(谷氨酸脫羧酶)、單增李斯特菌hly 和鼠傷寒沙門氏菌invA 基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行MPCR 擴(kuò)增，從小麥中同時(shí)檢測出這三種致病菌的［16］。

應(yīng)用多重PCR 可較好的區(qū)別單核細(xì)胞增多性李斯特菌和其他同屬異種的李斯特菌。劉海泉等［17］建立了四重PCR 方法檢測鮮活農(nóng)產(chǎn)品中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌。其以16S rRNA、inlAB、iap、hly 基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)引物，從影響多重PCR 擴(kuò)增的引物濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，英諾克李斯特氏菌、西爾李斯特氏菌、威爾西李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未擴(kuò)增出特異性的片段，單核細(xì)胞增多性李斯特菌的最低檢測限為102cfu/mL，模擬污染的生豬肉檢測限不大于0.4cfu/g。研究表明，應(yīng)用多重PCR 結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)對鮮活農(nóng)產(chǎn)品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌、綿羊李斯特菌和英諾克李斯特菌快速高通量檢測具有較好的特異性，是鮮活農(nóng)產(chǎn)品微生物快速檢測的新技術(shù)。其根據(jù)三種李斯特菌的特異基因序列分別設(shè)計(jì)引物，MPCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC 技術(shù)進(jìn)行快速檢測［18］。

2.1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)上運(yùn)用熒光能量傳遞技術(shù)，該技術(shù)加入熒光標(biāo)記探針，巧妙地把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測技術(shù)結(jié)合在一起，借助熒光信號(hào)來檢測PCR 產(chǎn)物。其可即時(shí)檢測熒光強(qiáng)度并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量，沒有復(fù)雜的產(chǎn)物后處理過程，具有快速靈敏的優(yōu)點(diǎn)［19］。劉仲敏等［20］根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫單核細(xì)胞增多性李斯特菌的O基因序列(AF253320)設(shè)計(jì)引物，建立單核細(xì)胞增多性李斯特菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.996，檢出底限約8 個(gè)細(xì)菌/反應(yīng)，而常規(guī)PCR 檢出底限約60 個(gè)細(xì)菌/反應(yīng)，體現(xiàn)了其較高的靈敏度。熊國華等［21］利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，建立了DNA 校正曲線、細(xì)胞校正曲線和質(zhì)粒校正曲線，DNA 校正曲線在1～32cfu/mL、細(xì)胞校正曲線在32～320cfu/mL、質(zhì)粒校正曲線在1～37Copies/mL，線形關(guān)系良好，且三種校正曲線檢測樣品得出的結(jié)果基本吻合，即在1～105cfu 或Copies/mL 線性范圍內(nèi)對樣品的檢測結(jié)果保持高度的一致性。

2.1.5 反轉(zhuǎn)錄PCR 技術(shù) 反轉(zhuǎn)錄PCR 是在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將mRNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，即用引物與mRNA 雜交，再以cDNA 作為模板，借助PCR 技術(shù)擴(kuò)增合成目的片段。由于反轉(zhuǎn)錄PCR 的起始材料一般是mRNA，而細(xì)菌中mRNA 在細(xì)菌死后很容易降解，所以可以較好的作為活菌的指示標(biāo)志。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR 可以有效的排除假陽性的產(chǎn)生［19］。Klein PG 等［22］使用這種方法已經(jīng)成功檢測到了經(jīng)人工污染肉樣中的單核細(xì)胞增多性李斯特菌，通過逆轉(zhuǎn)錄單核細(xì)胞增多性李斯特菌的hly、prfA 和iap 的mRNA，其中以iap 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄從而進(jìn)行PCR 檢測的特異性和靈敏度是最高的，檢出量為3cfu/g，檢出所需的總時(shí)間大約為54h。

2.1.6 競爭PCR 技術(shù) 競爭PCR 是將不同濃度的競爭模板和一定量的靶模板混合后進(jìn)行擴(kuò)增，用兩種擴(kuò)增產(chǎn)物的比值作競爭曲線，從曲線上得出靶模板的含量，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的定量檢測。Choi 等人［23］用hlyA基因序列為靶模板進(jìn)行競爭PCR，在沒有增菌的情況下可以在5h 內(nèi)測出103cfu/0.5mL 的牛奶樣品。

2.1.7 熒光原位雜交技術(shù) 熒光原位雜交(FISH)是將DNA 探針用熒光染料標(biāo)記，然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA 纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異結(jié)合，通過熒光雜交信號(hào)來檢測DNA 序列在染色體或DNA 纖維上的定位、定性、相對定量分析。Yolanda Moreno 等［24］采用選擇性鍍層、PCR、DVC-FISH 技術(shù)對191 個(gè)蔬菜樣品(新鮮的蔬菜、冷凍的蔬菜、氣調(diào)包裝下鮮切的蔬菜)進(jìn)行單核細(xì)胞增多性李斯特菌的檢測和鑒別，其中DVC-FISH 技術(shù)檢測出32.98%的樣品存在單核細(xì)胞增多性李斯特菌活菌，活菌數(shù)高達(dá)4.97lgcfu/g。

2.2 免疫學(xué)方法

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(ELISA)的原理是抗體與酶結(jié)合后仍能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，將待檢樣品事先吸附在固相載體表面，加入酶標(biāo)抗體，兩者發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，不能被緩沖液沖掉，當(dāng)加入酶的底物時(shí)，底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，呈現(xiàn)顏色變化，顏色深淺與待測抗原或抗體的量相關(guān)，借助分光光度計(jì)可定量測定抗原或抗體。Yu KY 等［25］將單核細(xì)胞增多性李斯特菌的iap 基因編碼的p60 作為抗原，采用單克隆抗體識(shí)別p60 的夾心ELISA 法，對單核細(xì)胞增多性李斯特菌進(jìn)行檢測，得到理想效果。ELISA 方法的缺點(diǎn)是容易受污染，靈敏度受抗體吸附能力影響，其主要問題是如何制備高特異性的抗體。目前大多數(shù)抗體主要針對李斯特菌屬的細(xì)菌，單核細(xì)胞增多性李斯特菌種特異性的抗體很少［26］。

2.2.2 酶聯(lián)熒光測定技術(shù) 目前酶聯(lián)熒光測定技術(shù)(ELFA)常用的標(biāo)記物為堿性磷酸酶。首先將單核細(xì)胞增多性李斯特菌抗原與單克隆抗體結(jié)合，再將結(jié)合有堿性磷酸酶的抗體與單核細(xì)胞增多性李斯特菌抗原結(jié)合。當(dāng)?shù)孜?-甲基傘形磷酸酮被磷酸酶轉(zhuǎn)換成4-甲基傘形酮時(shí)，發(fā)出熒光。測得的熒光強(qiáng)度與抗原含量成正比，由此可推算出樣品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的個(gè)數(shù)［27］。美國Vitek 公司生產(chǎn)的VIDAS 自動(dòng)免疫熒光檢測系統(tǒng)是利用微量免疫技術(shù)，將抗原與抗體的特異性反應(yīng)進(jìn)行免疫放大來鑒別細(xì)菌，樣品經(jīng)過Fraser 肉湯增菌48h，檢測敏感度達(dá)到10cfu/25g，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性為94.7%，滿足了快速檢測的要求［26］。該方法缺點(diǎn)是成本較高。

2.2.3 金標(biāo)試紙技術(shù) 金標(biāo)試紙技術(shù)的原理是特異性的抗單核細(xì)胞增多性李斯特菌及其單核細(xì)胞增多性李斯特菌抗原的抗體被縛在色原載體上，并且可與固相支撐基質(zhì)分離。當(dāng)有單核細(xì)胞增多性李斯特菌存在時(shí)，測試單元的試劑被展開，并產(chǎn)生可視的確定反應(yīng)。單核細(xì)胞增多性李斯特菌抗原與抗體色原復(fù)合物反應(yīng)，形成抗原-抗體-色原復(fù)合物。此復(fù)合物穿過側(cè)面流動(dòng)膜流動(dòng)，隨后與固定在膜上的抗體結(jié)合。陽性反應(yīng)在測試窗有一指示陽性的模線。研究發(fā)現(xiàn)，利用膠體金標(biāo)記和雙抗體夾心免疫層析技術(shù)建立的單核細(xì)胞增多性李斯特菌快速檢測方法可在10min 內(nèi)完成定性和半定量檢測，定量檢測靈敏度為3.5 × 103cfu/mL，限性范圍3.5 × 105～3.5 ×108cfu/mL，回收率在99%～101.7%之間［28］。

2.3 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)檢測

目前國內(nèi)外已研制出很多全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)，如VITEK 系統(tǒng)、BIOLOG 系統(tǒng)、MIDD 系統(tǒng)等。其中VITEK-單核細(xì)胞增多性李斯特菌的微生物鑒定系統(tǒng)已被國際分析化學(xué)協(xié)會(huì)(AOAC)列為法定分析法。利用微生物生化反應(yīng)的原理把30 個(gè)對細(xì)菌鑒定必需的生化反應(yīng)培養(yǎng)基固定到卡片上，然后通過培養(yǎng)后儀器對顯色反應(yīng)進(jìn)行判斷，利用數(shù)值法進(jìn)行判定。在檢測前同樣進(jìn)行常規(guī)的篩選培養(yǎng)，必要時(shí)需結(jié)合血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行最后鑒定。

2.4 生物傳感器檢測

生物傳感器是結(jié)合了生物感受器和物理或化學(xué)換能器的一項(xiàng)新技術(shù)，可以快速檢測少量的活性生物分子。它能滿足食品中病原微生物靈敏、實(shí)時(shí)檢測的要求，目前對食品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的檢測方面有了一些研究。

武會(huì)娟等［29］應(yīng)用F0F1-ATP 酶旋轉(zhuǎn)分子馬達(dá)和免疫技術(shù)相結(jié)合，建立免疫生物傳感器快速檢測技術(shù)。首先pH 變化敏感熒光物質(zhì)F1300 標(biāo)記到色素體的內(nèi)表面，然后在F0F1-ATP 酶上連接β 亞基抗體-生物素-鏈親和素-生物素-單核細(xì)胞增多性李斯特菌多抗復(fù)合體，得到可以捕獲單核細(xì)胞增多性李斯特菌的免疫生物傳感器。傳感器上負(fù)載菌量不同，酶活性不同，酶活變化以pH 敏感的熒光探針來感應(yīng)，最后通過熒光掃描儀檢測不同菌量負(fù)載下的熒光信號(hào)。結(jié)果表明，該方法對單核細(xì)胞增生李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 15313)的檢測時(shí)間為4.5h，檢出濃度為100cfu/孔。

目前的幾種快速檢測方法除了ELISA 法應(yīng)用于實(shí)際檢測外，分子生物學(xué)方法大多數(shù)用于科研。我國目前對鮮活農(nóng)產(chǎn)品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的檢測主要采用分離培養(yǎng)方法結(jié)合相關(guān)的顯色培養(yǎng)基和VITEK 系統(tǒng)進(jìn)行檢測，整個(gè)操作過程較復(fù)雜，檢測時(shí)間大多在2～3d，尚無法滿足對鮮活農(nóng)產(chǎn)品的實(shí)時(shí)檢測需要。因此開發(fā)一種快速、靈敏、簡潔、價(jià)廉的檢測方法是目前一個(gè)研究重點(diǎn)。

3 展望

以上綜述了鮮活農(nóng)產(chǎn)品中基于分子生物學(xué)、免疫學(xué)等技術(shù)的單核細(xì)胞增多性李斯特菌現(xiàn)階段幾種快速檢測手段，然而這些方法與傳統(tǒng)的檢測方法比較準(zhǔn)確性、靈敏度、檢測效率較低;成本較高。且還有很多方法尚停留在實(shí)驗(yàn)室階段，未推廣到實(shí)踐中應(yīng)用。但是隨著科學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)、免疫學(xué)、物理手段等的深入研究，對原有技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，多種相關(guān)技術(shù)聯(lián)用，以及不斷地運(yùn)用一些新的其他領(lǐng)域的技術(shù)到單核細(xì)胞增多性李斯特菌的檢測中，相信在不久的將來，一定會(huì)研制出合適于鮮活農(nóng)產(chǎn)品中單核細(xì)胞增多性李斯特菌的高效、便捷、靈敏、低廉的快速檢測技術(shù)。

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