秦 川，鄭宗平，曾茂茂，何志勇，陳 潔

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122)

雜環(huán)胺(heterocyclic aromatic amines，HAAs)是肉類等富含蛋白質(zhì)的食物在烹調(diào)過程中經(jīng)過一系列的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的致癌、致突變的化合物［1］。1977年，日本科學(xué)家在烤焦的牛肉、魚的表面發(fā)現(xiàn)潛在致突變物質(zhì)［2］。此后，人們對于此類烹調(diào)產(chǎn)生的致癌物質(zhì)的研究逐漸深入，此類致癌物質(zhì)即為雜環(huán)胺。雜環(huán)胺屬多環(huán)芳烴類化合物，對于富含蛋白質(zhì)的食物，300℃的加熱溫度是產(chǎn)生不同種類雜環(huán)胺的分界限，當(dāng)溫度大于300℃時(shí)，蛋白質(zhì)受熱分解產(chǎn)生的雜環(huán)胺為氨基咔啉類(amino-carbolines)［3］;溫度小于 300℃時(shí)產(chǎn)生的雜環(huán)胺為氨基咪唑氮雜芳烴類(aminoimidazole-azaarenes，AIAs)。氨基咔啉類雜環(huán)胺可分為α-咔啉類，β-咔啉類，γ-咔啉類和δ-咔啉類;而AIAS類雜環(huán)胺則可分為喹啉類(quinoline)，喹喔啉類(quinoxaline)和吡啶類(pyridine)。按極性劃分，雜環(huán)胺可分為極性雜環(huán)胺和非極性雜環(huán)胺。目前發(fā)現(xiàn)的雜環(huán)胺超過25種，其縮寫分別為:DMIP、1，5，6-TMIP、3，5，6-TMIP、PhIP、4′-OH-PhIP、IFP、iso-IQ、IQ、MeIQ、IQ、MeIQ、IQ［4，5-b］、4-MeIQx、8-MeIQx、7，8-DiMeIQx、4，8-DiMeIQx、4-CH2OH-8-MeIQx、TriMeIQx、IgQx、7-MeIgQx、6，7-DiMeIgQx、7，9-DiMeIgQx、Phe-P-1、AαC、MeAαC、Harman、Norharman、Trp-P-2、Trp-P-1、Glu-P-2、Glu-P-1、Orn-P-1、Cre-P-1、Lys-P-1。肉制品中的雜環(huán)胺含量因肉的種類，肉的加工、烹調(diào)方式的不同存在較大差異，但總體上處于ng級別。鑒于肉制品中的雜環(huán)胺含量極低，且易受到共提物的影響，行之有效的檢測方法顯得尤為關(guān)鍵，高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法成為近些年雜環(huán)胺檢測的主流方法。與此同時(shí)，隨著公眾對健康飲食需求的日益提高，如何對肉制品中致癌、致突變的雜環(huán)胺進(jìn)行有效抑制也成為當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本文概述了近二十年來肉制品中雜環(huán)胺的提取方法、檢測技術(shù)及抑制措施。

1 肉制品中雜環(huán)胺的提取及檢測方法

雜環(huán)胺僅以痕量水平(ng/g)存在于肉制品中，因此合理、高效的提取和檢測方法對于雜環(huán)胺的分析和研究至關(guān)重要。

1.1 肉制品中雜環(huán)胺的提取方法

肉制品中雜環(huán)胺的提取，第一步包含一個(gè)溶解的過程，采用不同的溶劑均質(zhì)樣品。溶劑分為有機(jī)溶劑和無機(jī)溶劑兩大類:有機(jī)溶劑包括丙酮、乙酸乙酯、甲醇等;無機(jī)溶劑包括水、鹽酸、氫氧化鈉等。第二步通常為用離心或過濾的方式除去肉制品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。而除雜最常用的技術(shù)為液液萃取，如果均質(zhì)溶劑為有機(jī)溶劑，那么萃取溶劑通常采用鹽酸;如果均質(zhì)溶劑為無機(jī)溶劑，那么萃取溶劑通常采用有機(jī)溶劑，如二氯甲烷［4-5］、乙酸乙酯［6-7］。而液液萃取通常與吸附劑萃取相結(jié)合。吸附劑通常采用硅藻土［4］，也有報(bào)道采用藍(lán)色人造纖維［8］。在對雜環(huán)胺進(jìn)行初步的前處理后，由 G A Gross［4］等提出的固相萃取法成為對雜環(huán)胺進(jìn)行進(jìn)一步分離和純化的常規(guī)方法，包括陽離子交換固相萃取和反相固相萃取。陽離子交換固相萃取的原理是化合物上與硅膠鍵合相的帶電基團(tuán)之間的相互吸引，而反相固相萃取的原理是分析物的碳?xì)滏I與硅膠表面官能團(tuán)的吸附作用。如G A Gross［4］等使用丙基磺酸柱(PRS)和反相C18柱進(jìn)行固相萃取;而 C Messner［7］等則使用 MCX 混合陽離子交換萃取柱進(jìn)行固相萃取。固相萃取的步驟一般包括柱子的活化、減壓干燥、上樣、清洗和洗脫。固相萃取后，對樣品進(jìn)行濃縮，通常使用氮?dú)獯蹈珊笤儆眉状既芙鈾z測。

1.2 肉制品中雜環(huán)胺的檢測方法

肉制品中雜環(huán)胺的檢測方法包括氣相色譜法(GC)，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS)，高效液相色譜—紫外檢測法(HPLC-UV)，高效液相色譜—熒光檢測法(HPLC-FD)，高效液相色譜—電化學(xué)檢測法(HPLC-ECD)，高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜法(HPLC-MS-MS)，超高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜法(UPLC-MS-MS)等。

1.2.1 氣相色譜法(GC) 絕大多數(shù)雜環(huán)胺都不易揮發(fā)且具有一定的極性，而且由于其對色譜柱的強(qiáng)吸附性易造成峰的拖尾，在較低濃度時(shí)雜環(huán)胺不易被檢出。因此，氣相色譜檢測之前通常要進(jìn)行衍生化處理。雜環(huán)胺經(jīng)衍生化處理后，不僅極性降低，而且揮發(fā)性、靈敏度、分離度也有較大提高［9］。

因?yàn)殡s環(huán)胺中存在氮原子，氣相色譜法檢測雜環(huán)胺通常采用氮磷檢測器(NPD)。H Kataoka［10］等人通過一種簡單、快速的衍生化方法，可以用氮磷檢測器檢測出10種雜環(huán)胺。但是AαC和Glu-P-2兩種雜環(huán)胺的色譜圖重疊在一起無法分開。

氣相色譜技術(shù)雖然具有較高的分離性能，但只有少數(shù)雜環(huán)胺能經(jīng)衍生化處理，且當(dāng)樣品中雜環(huán)胺濃度太低時(shí)，也存在著定量不準(zhǔn)確的缺陷，因此氣相色譜技術(shù)在雜環(huán)胺檢測領(lǐng)域應(yīng)用較少。

1.2.2 氣相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS) 由于結(jié)合了氣相色譜儀的高分離性能和質(zhì)譜儀的高選擇性和靈敏度，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)是最好的在線檢測方法之一［9］。有些報(bào)道［10-11］已經(jīng)證實(shí)雜環(huán)胺可以用GC-MS進(jìn)行檢測，但是也僅限于少數(shù)能經(jīng)衍生化處理的雜環(huán)胺檢測。L Warzecha［12］等用五氟丙酸酐(PFPA)對雜環(huán)胺進(jìn)行衍生;S Casal［13］等用添加1%叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMCS)的三氟乙酰胺(MTBSTFA)對雜環(huán)胺進(jìn)行衍生。另外，也有使用乙酸、三氟醋酸等衍生化試劑。

1.2.3 高效液相色譜法(HPLC) 所有的雜環(huán)胺都具有紫外吸收波長，且其具有一定的極性、不易揮發(fā)的特點(diǎn)，以及高效液相色譜—紫外檢測法(HPLCUV)操作相對簡便，不需要像氣相色譜法那樣進(jìn)行衍生化處理，使其成為過去數(shù)十年來用于雜環(huán)胺檢測的常規(guī)方法。對于有些能產(chǎn)生熒光信號的雜環(huán)胺，也可以通過熒光檢測器(FD)來進(jìn)行檢測。然而通常情況下，熒光檢測器(FD)作為紫外檢測器(UV)或二極管陣列檢測器(DAD)的補(bǔ)充以排除雜質(zhì)峰的干擾和更好的定量。高效液相色譜法的流動(dòng)相一般采用p H3.2～3.6的三乙胺磷酸緩沖液和乙腈。高效液相色譜法雖然是雜環(huán)胺研究最普遍的方法，最高可同時(shí)檢測出十幾種雜環(huán)胺，但也存在著靈敏度低，定量不準(zhǔn)確的缺陷。

應(yīng)用于高效液相色譜法測定雜環(huán)胺的反相色譜柱也是多種多樣，其中TSK gel ODS柱因峰型好，分離度高的特點(diǎn)而應(yīng)用最為廣泛［4，14-18］。G A Gross［4］等采用三元流動(dòng)相同時(shí)分離出12種致突變型雜環(huán)胺和2種非致突變型雜環(huán)胺harman和norharman。K Puangsombat［17］等用 0.01mol/L 的三乙胺磷酸緩沖液和乙腈進(jìn)行二元梯度洗脫，對熱狗等市售方便肉制品進(jìn)行雜環(huán)胺的含量測定，檢測出5種雜環(huán)胺:IQ、IQx、MeIQx、DiMeIQx、PhIP。而除了 TSK gel ODS 型色譜柱外，也有許多報(bào)道采用其它的色譜柱，如K W Cheng［19］等使用 YMC型 C18色譜柱研究水果提取物對雜環(huán)胺的抑制作用，檢測3種雜環(huán)胺(PhIP、4，8-DiMeIQx、MeIQx)含量的變化。

1.2.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)LC-MS很好地結(jié)合了色譜良好的分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度和高選擇性，并且通過高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜(LC-MS-MS)可以達(dá)到更佳的選擇性［20］。目前有3種離子化技術(shù)應(yīng)用于LC-MS中:熱噴霧(TSI)技術(shù)、電噴霧(ESI)技術(shù)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)技術(shù)，而 ESI和 APCI的靈敏度較 TSI更高。J Lee［21］等研究壓橄欖油對烤牛肉中雜環(huán)胺含量的影響，使用LC-MS檢測雜環(huán)胺含量變化，采用串聯(lián)單一四級桿檢測器(MSD)，流動(dòng)相為30mmol甲酸銨緩沖液和乙腈，色譜柱為RX-C8型，可同時(shí)測定15種雜環(huán)胺含量，回收率在35%～70%之間。

近些年來，超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)迅速發(fā)展，超高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜(UPLC-MS-MS)廣泛應(yīng)用于雜環(huán)胺含量測定［20］，具有分離度高，分析快速的優(yōu)點(diǎn)。呂美［22］等使用超高液相色譜—電噴霧串聯(lián)二級質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS-MS)檢測添加香辛料的牛肉中三種雜環(huán)胺(AαC、Norharman、PhIP)的含量變化，采用乙酸銨和乙腈作為流動(dòng)相，具有較好的定量效果。E Barceló -Barrachina［23］等使用 UPLCESI-MS-MS對凍干肉制品中的雜環(huán)胺進(jìn)行快速檢測，可以在2min內(nèi)完成對16種雜環(huán)胺的檢測分析。

2 肉制品中雜環(huán)胺的抑制措施

雜環(huán)胺具有潛在的強(qiáng)致癌和致突變作用，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)具有致癌和致突變作用，對人體健康也有可能帶來危害，因此如何抑制肉制品中雜環(huán)胺的產(chǎn)生是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前的研究主要集中在采取合理的烹調(diào)方式，降低烹調(diào)溫度和時(shí)間，添加香辛料，添加人工或合成的抗氧化劑和添加植物提取物等方面。

2.1 合理的烹調(diào)方式

近些年，許多研究表明，烹調(diào)方式對肉制品中雜環(huán)胺的種類、含量有很大的影響［24-27］。F Oz［24］等考察了不同烹調(diào)方法對雞肉和魚肉體系中雜環(huán)胺產(chǎn)生量的影響，分別采取微波加熱、烤箱、電爐、平底鍋煎炸和燒烤的方法。結(jié)果表明，微波加熱產(chǎn)生的雜環(huán)胺最多，其次為平底鍋煎炸和燒烤，而使用烤箱和電爐則產(chǎn)生較少的雜環(huán)胺。G Z Liao［25］等分別使用碳烤 (20min，200℃)、烤 箱 (20min，200℃)、油 炸(10min，180℃)、平底鍋煎炸(5min 每面，180℃)的方法烹調(diào)雞脯肉和鴨脯肉。結(jié)果表明，碳烤的雞脯肉中雜環(huán)胺含量最高，達(dá)到112ng/g，總體而言，碳烤和平底鍋煎炸產(chǎn)生的雜環(huán)胺相對較多。產(chǎn)生雜環(huán)胺含量過高可能的原因是:肉類與受熱平面直接接觸，如平底鍋煎炸;溫度過高，如燒烤［26］;水分流失，導(dǎo)致一個(gè)相對干燥的平面，而其附近的溫度更高，且形成的雜環(huán)胺的前體物質(zhì)富集，進(jìn)而通過一系列反應(yīng)生成雜環(huán)胺［27］。因此，采取合理的烹調(diào)方式，避免過高的溫度、直接與高溫?zé)嵩唇佑|和水分流失就能有效抑制雜環(huán)胺的產(chǎn)生。

2.2 降低烹調(diào)溫度和時(shí)間

研究表明，烹調(diào)溫度和時(shí)間對雜環(huán)胺的產(chǎn)生量也有巨大的影響［28-30］。M Bordas［28］等人在凍干肉類提取物和液態(tài)肉類提取物的模擬體系中對分別對溫度和時(shí)間對雜環(huán)胺的影響進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，較高的溫度和較長的烹調(diào)時(shí)間能夠使雜環(huán)胺的含量大幅上升。B G Abdulkarim［29］等人對火腿、香腸、臘腸進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)85℃沒有促進(jìn)雜環(huán)胺的生成，190～230℃雜環(huán)胺含量提高 2～5 倍。P Arvidsson［30］等人在肉汁體系中對 IQx，PhIP，MeIQx，7，8-DiMeIQx，4，8-DiMeIQx等多種雜環(huán)胺含量在不同溫度和時(shí)間下進(jìn)行了測定。結(jié)果表明125℃，加熱45min，可以檢測到IQx;而當(dāng)溫度上升到125～150℃后，多種雜環(huán)胺含量急劇上升;隨著時(shí)間的延長，雜環(huán)胺含量繼續(xù)上升，并逐漸趨于平緩。

2.3 添加香辛料

研究［22，31-35］表明，肉制品中添加香辛料可以顯著影響雜環(huán)胺的生成。J Dama?ius［31］等在牛肉中加入羅勒、牛至等香辛料，結(jié)果表明，添加羅勒、牛至均導(dǎo)致PhIP的含量升高;而添加羅勒可以降低Trp-p-1的含量，添加牛至卻導(dǎo)致Trp-p-1含量的上升;同時(shí)添加羅勒和牛至可以降低 Tro-p-2的含量。Z Balogh［32］等在牛肉中加入迷迭香，可以降低PhIP含量。E Persson［33］將迷迭香加入壓榨橄欖油中，可以降低牛肉漢堡中HAs含量。F Oz［34］等在高脂肪的肉球中加入黑胡椒，發(fā)現(xiàn)225℃的煎炸溫度下未添加黑胡椒的肉球產(chǎn)生的PhIP含量高達(dá)37.81ng/g;而添加黑胡椒的肉球則未檢測出PhIP。黑胡椒對PhIP的抑制效果達(dá)100%。K Puangsombat［35］等考察了幾種亞洲產(chǎn)香料對煎牛肉中雜環(huán)胺的抑制，發(fā)現(xiàn)姜黃可以使雜環(huán)胺總量降低39.2%，提琴形凹唇姜使雜環(huán)胺總量降低33.5%，而高良姜使雜環(huán)胺總量降低18.4%。呂美［22］等對中國傳統(tǒng)香辛料(高良姜、麻椒、花椒等)對煎炸牛肉餅中雜環(huán)胺形成的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，高良姜的抑制效果最好，對PhIP的抑制率為100%，且對AαC和Norharman也有較好的抑制作用，抑制率分別為77.27%和77.08%，對煎烤牛肉中雜環(huán)胺總量的抑制達(dá)到了78.32%。作者進(jìn)而對6種香辛料清除ABTS自由基的能力和其抑制雜環(huán)胺的能力進(jìn)行線性相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)不具有相關(guān)性，而這與 J Dama?ius［31］的結(jié)論一致，說明香辛料的抗氧化性并不是其對雜環(huán)胺存在抑制作用的原因。

2.4 添加天然或人工合成的抗氧化劑

天然抗氧化劑，如維生素、類胡蘿卜素、黃酮類化合物等，許多報(bào)道表明其對加工肉制品中雜環(huán)胺的產(chǎn)生具有明顯的抑制效果。D Wong［36］等考察了11 種水溶性維生素(VB1、VB2、VB3、VB5、PM、PN、PL、VB7、VB9、VC、VB12)對模擬體系和煎炸牛肉中兩種雜環(huán)胺(PhIP、MeIQx)含量變化的影響，結(jié)果表明6 種維生素(VB2、VB3、VB5、PL、VB9、VB12)對雜環(huán)胺的抑制作用超過40%。K W Cheng［37］等考察了12種酚類化合物對模擬體系和牛肉中雜環(huán)胺含量變化的影響，結(jié)果表明:柚皮苷、槲皮素等黃酮類化合物均能抑制PhIP的產(chǎn)生;而迷迭香酸、鼠尾草酸等酚酸類化合物則促進(jìn)了PhIP的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究表明［38-39］，柚皮素(naringenin)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)均可與雜環(huán)胺生成的中間產(chǎn)物苯乙醛結(jié)合，生成特定的化合物，從而間接抑制了雜環(huán)胺PhIP的生成。

而添加人工合成的抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)等也對雜環(huán)胺的生成有較大影響。C M Lan［40］等研究表明，BHT對雜環(huán)胺有輕微的抑制作用。但人工合成的抗氧化劑是否對人體存在潛在的危害，尚存在爭議。

2.5 添加植物提取物

目前，大量研究［19，41-44］表明植物提取物對雜環(huán)胺也具有明顯的抑制作用。K W Cheng［19］等研究4種植物提取物(蘋果、接骨木、葡萄、菠蘿)對三種雜環(huán)胺(PhIP、4，8-DiMeIQx、MeIQx)的抑制作用，結(jié)果表明:接骨木和菠蘿的提取物具有輕微的抑制作用，而蘋果和葡萄的提取物則有較強(qiáng)的抑制作用(約為70%)。M Gibis［41］等在腌泡汁中分別加入大蒜、洋蔥、檸檬來研究其對煎炸牛肉中雜環(huán)胺的抑制作用，發(fā)現(xiàn)三者最佳的抑制效果分別為31.2%，28.6%，14.6%。J Lee［21］等考察了初壓橄欖油(EVOO)對烤牛肉中15種雜環(huán)胺的抑制作用，結(jié)果表明，當(dāng)EVOO添加量在2～4g范圍內(nèi)時(shí)對雜環(huán)胺有較強(qiáng)的抑制作用，而添加額外的EVOO則促進(jìn)了某些雜環(huán)胺的生成。I Quelhas［42］等研究了綠茶對四種雜環(huán)胺(PhIP、AαC、4，8-DiMeIQx、MeIQx)的抑制作用，將牛肉事先用綠茶浸泡數(shù)小時(shí)進(jìn)而煎炸。結(jié)果表明綠茶對PhIP和AαC兩種雜環(huán)胺有較為明顯的抑制作用，且隨著浸泡時(shí)間的變化，雜環(huán)胺含量也有較大差異，而4，8-DiMeIQx和MeIQx兩種雜環(huán)胺的含量則沒有明顯的變化。

3 結(jié)語

近些年，隨著人們對于飲食健康要求的日益增大，肉制品中雜環(huán)胺的研究也日益深入，而雜環(huán)胺的檢測技術(shù)也逐漸提高，UPLC-MS-MS等先進(jìn)的分析技術(shù)越來越多的應(yīng)用于雜環(huán)胺的檢測中。與此同時(shí)，雜環(huán)胺抑制作用機(jī)理的研究也在逐漸發(fā)展和深入。相信在不久的將來，一定能夠找到簡單、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的抑制雜環(huán)胺的措施，并且建立一個(gè)完善的加工肉制品中雜環(huán)胺的檢測標(biāo)準(zhǔn)。

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