費(fèi)建明 孔 莉 施國(guó)方 占鵬飛 吳 巖 白雪川 王文兵

(1浙江省湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江湖州 313000;2江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

L－天冬酰胺酶是一種酰胺基水解的酶類藥物，廣泛應(yīng)用于兒童急性淋巴細(xì)胞白血病治療［1］，尤其對(duì)急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效［2］。目前，L－天冬酰胺酶的生產(chǎn)大多采用以大腸桿菌為宿主的基因工程菌，表達(dá)產(chǎn)物主要位于細(xì)胞周質(zhì)，用破碎細(xì)胞壁的方法純化不僅步驟繁瑣，還易導(dǎo)致蛋白污染［3］。費(fèi)建明等［4］曾利用多角體融合表達(dá)了L－天冬酰胺酶，結(jié)果表明融合表達(dá)的基因產(chǎn)物具有活性，但對(duì)多角體的形成有一定影響。da26 基因編碼桿狀病毒的一種包膜蛋白，可以吸附于多角體的外膜上。將L－天冬酰胺酶的成熟肽序列asp(s)與da26融合表達(dá)，可以通過(guò)超聲裂解和差速離心法將外源蛋白分離純化［5－6］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)此方法與多角體融合表達(dá)的方法作比較，分析較優(yōu)的表達(dá)形式，促進(jìn)我國(guó)歷史悠久的蠶桑業(yè)向更高層次發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌DH5α、pFastbacdual 載體、DH 10BacTM、BmN 細(xì)胞，由江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)組實(shí)驗(yàn)室保存。SmaⅠ、XbaⅠ、SphⅠ等限制性內(nèi)切酶，T4 DNA 連接酶、質(zhì)粒柱抽試劑盒、膠回收試劑盒等購(gòu)自TaKaRa 公司;TC－100 培養(yǎng)基、FBS 等購(gòu)自Hy-Clone 公司。PCR 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因的克隆及序列測(cè)定 根據(jù)Gen-Bank 中家蠶桿狀病毒da26 序列，設(shè)計(jì)da26 引物，在上游引物 P1:TCCCCCGGGATGAATTCTGTTCAACG 的5'端引進(jìn)SmaⅠ酶切位點(diǎn);在下游引物P2:GCTCTAGAGCAATAGGCGTTAATATCACTTTG 的5'端引進(jìn)XbaⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線表示酶切位點(diǎn)，以下相同)。根據(jù)大腸桿菌JM109 基因組DNA 序列中L－天冬酰胺酶成熟區(qū)的DNA 片段，設(shè)計(jì)大腸桿菌引物，在上游引物P3:GCTCTAGAGCCCATCACCATCACCATCAC 的5'端引進(jìn)XbaⅠ酶切位點(diǎn);在下游引物P4:ACATGCATGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT 的5'端引進(jìn)SphⅠ酶切位點(diǎn)。PCR 擴(kuò)增的da26 和asp(s)產(chǎn)物分別用XbaⅠ單酶切，瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切產(chǎn)物并作連接，得到Da26-asp(s)連接產(chǎn)物。用Da26-asp(s)連接產(chǎn)物做模板，da26上游引物 P1:TCCCCCGGGATGAATTCTGTTCACACG，asp(s)下游引物P4:ACATGCATGCTTAGTACTGATTGAAGATCTGCT 再作PCR 擴(kuò)增。電泳回收后與T 載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。質(zhì)粒抽提等基因操作參照文獻(xiàn)［4］的方法進(jìn)行。經(jīng)酶切鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.2 轉(zhuǎn)移載體pFastdual-polh-da26-asp(s)以及穿梭載體的構(gòu)建 用SmaⅠ和SphⅠ分別雙酶切測(cè)序正確的Da26-asp(s)重組質(zhì)粒獲得Da26-asp(s)片段，同樣酶切本研究組先前構(gòu)建的含polh 基因(置于polh 啟動(dòng)子下)的pFastdual-polh 重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳回收后連接轉(zhuǎn)化，將片段克隆至載體的p10 啟動(dòng)子下，得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastdual-polhda26-asp(s)。將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體pFastdual-polhda26-asp(s)轉(zhuǎn)化為DH10BacTM，涂布于含有Kan(50 μg/mL)、Gen(7 μg/mL)、Tet(10 μg/mL)、Xgal(1 mg/mL)和IPTG(0.8 mg/mL)的LB 固體培養(yǎng)基上。48 h 后挑取白色菌落接種于LB 培養(yǎng)液中，12～14 h 后提取重組DNA。用pUC/M13 引物(M13 Forward:5'-GTTTTCCCAGTCACG AC－3'，Reverse:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')PCR 鑒定正確后，得到重組Bac-polh-da26-asp(s)。

1.2.3 Bm-Bac-polh-da26-asp(s)DNA 轉(zhuǎn)染Bm 細(xì)胞 將生長(zhǎng)良好的BmN 細(xì)胞接種35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，27 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后更換無(wú)血清培養(yǎng)液，將提取的重組Bac-polh-da26-asp(s)DNA 在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染家蠶BmN 細(xì)胞，2 h 后加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察細(xì)胞感染癥狀。至癥狀明顯時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，對(duì)正常細(xì)胞進(jìn)行復(fù)感染，獲得重組病毒。將收集的重組病毒大量感染細(xì)胞，觀察到細(xì)胞內(nèi)有多角體產(chǎn)生時(shí)，收集細(xì)胞用于L－天冬酰胺酶的活性分析。

1.2.4 L－天冬酰胺酶活性分析 以奈氏試劑檢測(cè)L－天冬酰胺酶的活性。將已知濃度的硫酸銨作為標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)為排除桿狀病毒自身可能的影響，以野生型BmNPV 作陰性對(duì)照。將上述感染后收集的細(xì)胞懸浮于2 mL PBS 中，置于冰上超聲波破碎，強(qiáng)度為70 Hz，每超聲15 s，于冰水中靜置15 s，反復(fù)20 次，超聲結(jié)束后進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，將各樣品的濃度調(diào)整一致后置于4 ℃?zhèn)溆?。L－天冬酰胺酶活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)［4］的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段的克隆及重組轉(zhuǎn)移載體的鑒定

Da26-asp(s)的連接產(chǎn)物經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，片段大小與預(yù)期的一致(圖1)。將重組得到的質(zhì)粒pFastdual-polh-da26-asp(s)用SmaⅠ和XbaⅠ雙酶切，得到約1 800 bp 插入片段，其大小與da26 加上His 標(biāo)簽，加上TEV 酶酶切位點(diǎn)，再加上asp(s)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列一致。結(jié)果表明重組轉(zhuǎn)移載體pFastdual-polh-da26-asp(s)構(gòu)建成功(圖2)。

圖1 Da26-asp(s)的連接產(chǎn)物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 重組轉(zhuǎn)移載體pFastdual-polh-da26-asp(s)的雙酶切鑒定

2.2 重組病毒感染家蠶細(xì)胞

用BmN、重組病毒Bacdual-polh-da26-asp(s)、重組病毒BacHTB-his-asp(本研究組先前構(gòu)建)分別感染家蠶細(xì)胞，72 h 后觀察細(xì)胞感染及多角體的產(chǎn)生情況。BmNPV 感染家蠶細(xì)胞產(chǎn)生的多角體數(shù)量較多，重組病毒Bacdual-polh-da26-asp(s)感染的多角體產(chǎn)生數(shù)量較少，重組病毒BacHTB-his-asp 不產(chǎn)生多角體(圖3)

2.3 L－天冬酰胺酶活性分析

根據(jù)硫酸銨的濃度制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出在家蠶細(xì)胞BmNPV 中表達(dá)的融合蛋白Da26-asp(s)的天冬酰胺酶活性為2 279.87 U/mg，比His 標(biāo)簽融合的天冬酰胺酶活性(2 800.00 U/mg)略低(圖4)。

圖3 不同病毒感染家蠶細(xì)胞多角體的生成(200 倍)

圖4 BmNPV 表達(dá)的L-天冬酰胺酶活性比較

3 討論

利用桿狀病毒da26 基因產(chǎn)物的性質(zhì)將其與L－天冬酰胺酶的成熟肽序列融合表達(dá)，這種表達(dá)的融合產(chǎn)物具有一定的活性，但沒有以His 標(biāo)簽融合表達(dá)的L－天冬酰胺酶活性高，其原因可能與蛋白的融合方式有關(guān)，也有可能是不同的啟動(dòng)子效率造成的。因His 融合表達(dá)是在多角體基因(polh)啟動(dòng)子調(diào)控下，其啟動(dòng)活性高于另一個(gè)桿狀病毒晚期基因的啟動(dòng)子p10。但為便于感染和純化，作者利用雙啟動(dòng)子，一個(gè)表達(dá)外源蛋白，一個(gè)表達(dá)多角體，這樣設(shè)計(jì)使病毒粒子可以包被于多角體中，便于生產(chǎn)上接種家蠶蟲體，同時(shí)表達(dá)產(chǎn)物能吸附于多角體上，易于純化。但由于表達(dá)量略有下降，表達(dá)形式還需進(jìn)一步改進(jìn)。

［1］吳曉英，吳振強(qiáng)，林影，等.L－天冬酰胺酶的研究進(jìn)展［J］.廣東藥學(xué)，2003，6(13):42－44.

［2］劉紅，潘紅春.抗癌藥物L(fēng)－天冬酰胺酶及其研究進(jìn)展［J］.四川輕化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，2(13):31－36.

［3］王利群，黃達(dá)明，趙希岳，等.胞外表達(dá)L－天冬酰胺酶發(fā)酵條件的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(33):16 280－16 281.

［4］費(fèi)建明，吳巖，占鵬飛，等.家蠶BmNPV 多角體蛋白與大腸桿菌L－天冬酰胺酶Ⅱ的融合表達(dá)［J］.中國(guó)蠶業(yè)，2011，32(2):29－31.

［5］Imai N，Kurihara M，Matsumoto S，et al.Bombyx mori nucleopolyhedrovirus orf8 encodes a nucleic acid binding protein that colocalizes with IE1 during infection［J］.Archives of Virology，2004，149(8):1 581－1 594.

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