王遠(yuǎn)锏 黃浩勝 陳震宇

【摘 要】來自于細(xì)菌和真菌等微生物的L-天冬酰胺酶通過切斷癌細(xì)胞L-天冬酰胺的來源實(shí)現(xiàn)治療癌癥，本身存在如低毒性、致敏性等問題。使用的重組表達(dá)載體將具有無谷氨酰胺酶活性L-天冬酰胺酶提取并生產(chǎn)，擴(kuò)大L-天冬酰胺酶表達(dá)能力并提高其工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

【關(guān)鍵詞】L-天冬酰胺酶；重組表達(dá)載體；

1 結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、作用機(jī)理

癌細(xì)胞無法合成天冬酰胺而從周圍細(xì)胞中獲取。L-天冬氨酸酶降解L-天冬酰胺，切斷癌細(xì)胞L-天冬酰胺來源抑制癌細(xì)胞生長。大腸桿菌中細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)L-天冬酰胺酶I組成型，具有低速水解L-天冬酰胺（L-Asn）與L-谷氨酰胺（L-Gln）的能力；在缺氧條件下，大腸桿菌周質(zhì)空腔中積累形成包涵體，具有抗蛋白酶、對(duì)宿主毒性小、容易富集純化等優(yōu)點(diǎn)。L-天冬酰胺酶II為4亞基同聚體，該酶的四聚體形態(tài)具有活性，活性中心包括Lys、Cys、His三個(gè)氨基酸。細(xì)菌來源的L-天冬酰胺酶具有少量的谷氨酰胺酶活性，易產(chǎn)生過敏與超敏反應(yīng)、血栓及出血等副作用，對(duì)肝臟毒害較大。

2 來源與生產(chǎn)

L-天冬酰胺酶在多種微生物體內(nèi)均有表達(dá)，大腸桿菌是天冬酰胺酶藥物最初來源，其L-天冬酰胺酶表達(dá)系統(tǒng)研究較為清楚。根據(jù)L-天冬酰胺酶II基因表達(dá)與ansB啟動(dòng)子有關(guān)[1]，受cAMP受體蛋白正調(diào)控與厭氧負(fù)調(diào)控。當(dāng)胞內(nèi)為低水平葡萄糖含量，cAMP含量升高，cAMP-cAMP受體蛋白復(fù)合物含量增加并結(jié)合ansB啟動(dòng)子中CAP結(jié)合位點(diǎn)，σ70RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合強(qiáng)度提高，基因表達(dá)水平上升。除了大腸桿菌之外，真菌也是研究生產(chǎn)L-天冬酰胺酶的對(duì)象，Vijay[2]使用土曲霉MTCC1782作為培養(yǎng)對(duì)象生產(chǎn)L-天冬酰胺酶，產(chǎn)物產(chǎn)量與安全性都有提高。

3 L-天冬酰胺酶重組表達(dá)體系

在L-天冬酰胺酶的生產(chǎn)體系中主要包括大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)、巴斯德畢赤酵母菌表達(dá)系統(tǒng)。低成本，高產(chǎn)量，生產(chǎn)周期短的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)目前較為常用，梁毅偈等[3]完成了大腸桿菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)，但產(chǎn)物無法正確折疊?？莶菅挎邨U菌表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)分泌能力強(qiáng)，分泌蛋白純化難度低。Feng Y等[4]將基因與含p43強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體pP43NMK重組并導(dǎo)入Bacillus subtilis WB600，在宿主菌中成功實(shí)現(xiàn)L-天冬酰胺酶II的重組表達(dá)。另外修改組合策略可提高L-天冬酰胺酶在宿主體內(nèi)的表達(dá)水平。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以對(duì)自身表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行加工，生產(chǎn)的L-天冬酰胺酶更加安全，目前Nagarajan A[5]等人從內(nèi)生真菌中成功篩選并分離到新型無谷氨酰胺酶L-天冬酰胺酶。酵母表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)可以適應(yīng)高密度發(fā)酵，重組體系產(chǎn)品易于純化，是目前一種具有較高應(yīng)用潛力的的L-天冬酰胺酶表達(dá)體系。

參考文獻(xiàn)：

[1] ?ebnem E，Hikmet G.Cloning，isolation and expression of l -asparaginase gene（ansB）in different gram-negative bacteria expressing Vitreoscilla hemoglobin[J].Curr Opin Biotech，2011，22.

[2] Vijay B，Raju K J.Production of L-asparaginase by Aspergillus terreus MTCC 1782 under solid state fermentation using pearl millet and finger millet as mixed substrate[J]J Chem，Biol Phys Sci.2015，5（1）：366-377.

[3] 梁毅偈，孫運(yùn)軍，胡勝標(biāo)，等.大腸桿菌Nissle1917L-天冬酰胺酶Ⅱ基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)與抗腫瘤活性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2014，41（4）：607-613.

[4] Feng Y，Liu S，Jiao Y，et al. Enhanced extracellular production of L-asparaginase from Bacillus subtilis 168 by B.Subtilis WB600 through a combined strategy[J]Appl Microbiol Biot.2017，101（4）：1509-1520.

[5]Nagarajan A，Thirunavukkarasu N，Suryanarayanan T S，et al.Screening and isolation of novel glutaminase free L-asparaginase from fungal endophytes[J] Res J Microbiol.2014，9（4）：163-176.

（作者單位：華南師范大學(xué)（石牌校區(qū)）生命科學(xué)學(xué)院）