徐書琴，胡靜怡，張恒維，趙浩東，劉 鵬，席毓淋，李 谞，張 顯*，饒志明

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

L-天冬酰胺酶能夠通過水解脫氨基反應，將L-天冬酰胺催化形成L-天冬氨酸和氨[1]。目前E.coli、Erwinia chrysanthemi及Erwinia carotovora等微生物來源的L-天冬酰胺酶已經(jīng)被廣泛應用于治療多種疾病，如急性淋巴白血病和淋巴肉瘤等[2]。但是，該酶的半衰期短、酶活性低、具有副催化反應等缺陷導致在臨床應用時會出現(xiàn)一些較嚴重不適應性。

此外，有研究表明，L-天冬酰胺酶除了在醫(yī)藥方面有非常廣泛的應用，其在食品行業(yè)也有較好的應用前景。在食品加工處理過程中會產(chǎn)生一種致癌物質(zhì)丙烯酰胺，而在食品加工處理前加入適量的L-天冬酰胺酶可以有效降低食品中丙烯酰胺的含量。Pedreschi研究顯示，在食品預處理過程中加入L-天冬酰胺酶可以使丙烯酰胺的含量下降約92.28%[3]。由于酶促反應的條件一般較溫和，在食物加工預處理階段加入L-天冬酰胺酶，不僅能達到減少丙烯酰胺含量的目的，還不會對食品風味產(chǎn)生較大的影響[4]。并且經(jīng)過前期的研究證實，在該反應過程中不會生成對人身體有害的物質(zhì)，因此利用酶法預處理需高溫加工的食品原料，是一種可從源頭上減少食物中丙烯酰胺生成的有效方法。

近年來，L-天冬酰胺酶在食品產(chǎn)業(yè)的應用研究及開發(fā)已經(jīng)受到越來越多的關注，也面臨著一些新的挑戰(zhàn)。由于食品加工預處理環(huán)境條件的復雜性，這就要求酶在較廣的pH和溫度范圍保持高的催化活力。目前，耐高溫、耐酸堿、高比酶活的L-天冬酰胺酶在食品工業(yè)方面具有更高的潛在應用價值。

為了獲得具有滿足工業(yè)生產(chǎn)及應用需求的蛋白質(zhì)分子，蛋白質(zhì)工程手段已被廣泛應用于對酶蛋白功能和結構進行改良的研究中[5]。2013年Vidya等研究發(fā)現(xiàn)對Escherichia sp.中L-天冬酰胺酶進行點突變后，蛋白質(zhì)表面環(huán)上電荷得到優(yōu)化，且有效增加了酶的熱穩(wěn)定性[6]。龍水清等對Bacillus subtilis B11-06的L-天冬酰胺酶（BsAII）進行定點突變，篩選得到的L-天冬酰胺酶突變體具有更高的比酶活以及熱穩(wěn)定性[7-8]。

作者基于課題組前期將Pyrococcus yayanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶在Bacillus subtilis168中成功克隆表達的基礎上，進一步采用分子模擬、定點突變等手段對其進行改造以期提高其比酶活和熱穩(wěn)定性，進一步提高其工業(yè)應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

E.coli和B.subtilis穿梭質(zhì)粒pMA5、克隆宿主E.coli JM109、表達宿主B.subtilis 168由作者所在實驗室保存。限制性核酸內(nèi)切酶、PrimeSTAR?HS DNA聚合酶和T4DNA連接酶：購自TaKaRa生物公司（大連，中國）；小型質(zhì)?？焖俜蛛x試劑盒、DNA提取試劑盒和Mini DNA快速純化試劑盒等：購自Sangon Biotech Co.，Ltd（上海，中國）；HisTrapTM HP柱：購自GE Healthcare，Inc（英國）。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 L-天冬酰胺酶基因定點突變和重組質(zhì)粒的構建以實驗室已構建的重組質(zhì)粒pMA5-asn為模板，每一個擬突變株設計2條含有突變位點及重疊部分的引物（見表1）[9]，利用這些突變引物通過PCR的方法，使基因在重疊延伸的過程中攜帶上目的突變點。將獲得的PCR產(chǎn)物用BamH I和Mlu I限制性核酸內(nèi)切酶進行雙酶切，并利用瓊脂糖凝膠電泳回收該雙酶切產(chǎn)物，與同樣進行了雙酶切及瓊脂糖凝膠電泳回收的線性化穿梭質(zhì)粒pMA5，利用T4 DNA連接酶于16℃連接12 h，并將所得連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli JM109感受態(tài)細胞，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切驗證后，再進行測序，檢測是否正確引入突變點，并將突變正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌Bacilus subtilis 168感受態(tài)細胞中。

表1 基因克隆及定點突變引物Table 1 Primers used for site-directed mutagenesis and

1.2.2 L-天冬酰胺酶的表達和純化將重組枯草芽孢桿菌接種至含有終質(zhì)量濃度為20μg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中（成分（g/L）：NaCl 10，蛋白胨10，酵母浸出物5），于37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h，作為種子液。取1 mL該種子液接種在100 mL的新鮮LB培養(yǎng)基上，并在相同條件下培養(yǎng)24 h，得到擴培后的重組枯草芽孢桿菌細胞。將獲得的細胞于4℃、10 000 r/min離心10 min，取其上清液作為胞外粗酶液，用于胞外L-天冬酰胺酶酶活測定。取其細胞用裂解緩沖液（50 mmol Tris-HCl緩沖液，pH 8.0）重復洗滌細胞2～3次后，然后在細胞裂解緩沖液中加入6 mg/mL溶菌酶，放置2 h，再于20 MHz，45%功率下，超聲處理細胞30 min。將所得細胞裂解物在12 000 r/min下離心25 min，收集上清液作為胞內(nèi)粗酶液，于-20℃保藏。

胞內(nèi)粗酶液的分離純化采取Ni2+親和層析和AKTA純化系統(tǒng)（GE Healthcare，瑞典）。以0.5 mL/min的流速將粗酶液加載到利用結合緩沖液（0.02 mol Tris-HCl緩沖液，0.5 mol NaCl，pH 7.4）平衡后的1 mL HisTrap TMHP柱上。采用0～0.5 mol的咪唑線性梯度，1 mL/min的流速洗脫L-天冬酰胺酶。然后將純化后的酶用PB緩沖液（0.05 mol，pH 7.0）或Tris-HCl緩沖液（0.05 mol，pH 7.0）透析，除去酶液中殘存的咪唑。并將最終純化后的酶進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.2.3 L-天冬酰胺酶酶活的測定L-天冬酰胺酶活力采用Long和Zuo等人的奈斯勒試劑法，通過測定酶促反應所生成氨的量來計算酶促反應速率[10-11]。酶活力單位定義：在一定條件下，每分鐘內(nèi)產(chǎn)生1μmol氨氣所需的酶量為1個酶活單位，采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度[12]。在95℃下對底物（1 mL的25 mmolL-天冬酰胺和50 mmol、pH 8.0 Tris-HCl混合物）進行預熱后，加入100μL酶溶液，反應進行10 min后加入100μL 15 g/dL的三氯乙酸（TCA）終止反應。反應后的混合物體系以20 000 r/min離心10 min，取200μL澄清上清液加入4.8 mL去離子水中，并加入200μL奈斯勒試劑反應，在450 nm的分光光度計下檢測系統(tǒng)中釋放的氨的量。對照組在酶促反應前加入100μL的15 g/dL三氯乙酸提前終止反應，以除去由于高溫下L-天冬酰胺自水解帶來的誤差。

1.2.4 L-天冬酰胺酶最適溫度、最適pH及溫度穩(wěn)定性測定最適溫度測定：在pH 8.0條件下，40～100℃的溫度范圍內(nèi)進行酶反應，測定不同溫度下的L-天冬酰胺酶酶活，并依此確定其最適溫度。

最適pH測定：保持溫度為95℃，在不同pH值條件下進行酶反應測定其對應的L-天冬酰胺酶酶活。根據(jù)所需的pH值范圍采用的不同pH緩沖液分 別 為：0.05 mol乙 酸 鹽 緩 沖 液，pH 4.0～6.0；0.05 mol磷酸鹽緩沖液，pH 6.0～7.0；0.05 mol Tris-HCl緩沖液，pH 7.0～9.0；0.05 mol甘氨酸-NaOH緩沖液，pH 9.0～10.0。

溫度穩(wěn)定性檢測：將含L-天冬酰胺酶的Tris-HCl緩沖液（50 mmol，pH 7.0），置于85℃水浴鍋中15～120 min，再在冰上重新折疊15 min，并在95℃、pH 8.0的條件下測定體系中殘余的L-天冬酰胺酶酶活性。

1.2.5 L-天冬酰胺酶三維結構模擬及分析使用Prot Param來預測L-天冬酰胺酶的相對分子質(zhì)量、理論pI和不穩(wěn)定指數(shù)。通過使用SWISS-MODEL同源建模獲得L-天冬酰胺酶的結構模型，并使用VERIFY_3D服務器對模型質(zhì)量進行檢測[13-14]。利用PYMOL軟件分析氨基酸殘基之間的相互作用[15]。

2 結果與分析

2.1 L-天冬酰胺酶分子建模突變點選擇

Pyrococcus yayanosii CH1 L-天冬酰胺酶是由987個堿基編碼而成的具有328個氨基酸的蛋白質(zhì)酶。經(jīng)ProtParam預測得到L-天冬酰胺酶相對分子質(zhì)量大小約為3.61×104，理論pI值約為5.16，不穩(wěn)定指數(shù)約為29.80，可認為該酶有較好的穩(wěn)定性[16]。為了對獲得的實驗結果進行更深層次的分析，將L-天冬酰胺酶PyAsnase的氨基酸序列上傳到SWISSMODEL服務器，選擇了與其序列相似度達到65%的同源二聚體蛋白為模板，得到了L-天冬酰胺酶的三維結構模型。并利用VERIFY▁3D服務器對獲得模型的質(zhì)量進行數(shù)據(jù)分析，結果顯示92.02%的殘基的平均3D-1D的評分大于0.2，已達到了質(zhì)量檢測的標準（≥80%的殘基的3D-1D評分大于0.2）[9]，可以用于更進一步的研究分析。

為了提高Pyrococcusya yanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶的比酶活和熱穩(wěn)定性，挑選3條酶活較高且為嗜熱來源的L-天冬酰胺酶，將這些酶的氨基酸序列進行對比（見圖1），從而確定與酶活性有關的氨基酸位點以及在高度保守序列附近可能會提高P.yayanosii CH1來源L-天冬酰胺酶的比酶活或熱穩(wěn)定性的突變位點。其中，結合近年來學者們對L-天冬酰胺酶的活性位點的研究，作者認為高度保守的11T、21Y、52S、83T、84D、154K位點為該L-天冬酰胺酶與酶活性有關的位點。在高度保守序列附近，我們發(fā)現(xiàn)P.yayanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶的氨基酸序列中E22、M92、R111位點與其他3個嗜熱來源L-天冬酰胺酶的氨基酸序列差別較大，且其余3個嗜熱來源的氨基酸序列在這些位點具有較好的保守性，因此選擇這3個位點作為突變位點。突變位點在酶空間結構上的位置如圖2所示。

圖1 不同來源L-天冬酰胺酶氨基酸序列對比結果Fig.1 Sequences alignment of L-asparaginases from different bacteria

圖2 來自Pyrococcus yayanosii CH1的L-天冬酰胺酶三級結構及突變位點示意圖Fig.2 Tertiary structure of the P.yayanosii CH1 Lasparaginase and schematic diagram of the mutation sites

2.2 L-天冬酰胺酶突變后酶學性質(zhì)的研究

按照上述實驗方法測定酶的最適溫度及最適pH，所得結果如表2所示?？梢钥闯?，突變前后酶的最適溫度與最適pH基本保持不變，最適溫度約為95℃，最適pH值約為8.0。在最適溫度（95℃）及最適pH（8.0）條件下分別測定突變體酶與原始酶的酶活，結果顯示，E22K突變體酶的酶活約為2 037.13 U/mg，較原始酶酶活（約1 483.81 U/mg）相比提高了約37.3%。R111L突變體酶的酶活約為1 945.11 U/mg，相比于原始酶提高了31.3%。M92A突變體酶的酶活約為1 421.78 U/mg，是原始酶的95%。即可以認為，E22、R111位點的突變可以進一步提高酶的比酶活。M92號位點的突變雖然導致酶活降低，但是波動幅度較小。

表2 突變體酶的酶學性質(zhì)Table 2 The enzymatic properties of the wild-type and its variants

為了進一步了解酶的熱穩(wěn)定性變化，將含突變體酶與原始酶的緩沖液在85℃水浴鍋中放置15～120 min，再在冰上重新折疊15 min，并在95℃、pH 8.0的條件下測定體系中殘余的L-天冬酰胺酶酶活性。其中，原始酶、E22K和R111L突變體酶在85℃下，放置105 min仍有較高的酶活，熱穩(wěn)定性基本保持不變。M92A突變體酶在85℃下放置135 min仍有較高的酶活，相比于原始酶延長了30 min。因此，將M92號位點突變成A92在提高酶的熱穩(wěn)定性方面有較好的效果。

2.3 突變體酶三維結構分析

為了分析突變體酶E22K、M92A、R111L的酶活或者熱穩(wěn)定性提高的原因，根據(jù)建立的L-天冬酰胺酶蛋白質(zhì)結構模型，從氨基酸殘基間的相互作用力和空間的結構變化的角度來對實驗結果進行分析，其變化情況見圖3。

圖3 突變前后氨基酸殘基的蛋白質(zhì)三維結構對比Fig.3 Tertiary structures of the wild-type and mutant enzymes

一般認為，活性區(qū)域附近的高柔性及更利于底物、產(chǎn)物進入活性口袋的酶結構會使酶出現(xiàn)較高的比酶活和較低的活化能[17-18]。而從圖3可以看出，突變殘基E22K與R111L分別位于不同的柔性環(huán)上。突變前E22與S17、K274殘基形成氫鍵，而突變后，K22與這2個氨基酸殘基不能再形成氫鍵，這種與周圍氨基酸殘基氫鍵相互作用的減弱，可能會增加酶活性中心的柔韌度，更有利于對底物的捕捉以及產(chǎn)物的釋放，進而提高酶的比活力。同樣，突變后的L111不能再與G117形成氫鍵，增加了酶活性中心的柔韌度，而且突變后的L111的殘基比突變前R111的殘基小，產(chǎn)生的空間位阻相對較小，進一步促進了底物和產(chǎn)物的進出，從而提高了酶的比活力。

蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性一般與蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水性、表面的親水性、表面電荷分布以及分子內(nèi)氨基酸殘基的相互作用等有關。從氨基酸殘基的蛋白質(zhì)三維結構圖可以看出第92位氨基酸位于α-螺旋中，且將M92換成A92后，酶的熱穩(wěn)定性得到了較大幅度的提高，這表明92號位點對P.yayanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶維持三維結構的穩(wěn)定性有重要的作用。

3 結語

在前期的研究中，學者們大多對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等來源的L-天冬酰胺酶進行蛋白質(zhì)工程改造，獲得的L-天冬酰胺酶突變體熱穩(wěn)定性雖然有所提高，但受到酶來源的限制，其穩(wěn)定性仍有較高的提升空間。而本實驗中利用熱穩(wěn)定性良好的嗜熱P.yayanosii CH1來源的L-天冬酰胺酶，通過分子模擬、定點突變等技術對其進行分子改造，進一步提高了該酶的比活力和熱穩(wěn)定性，提高了其在工業(yè)、食品方面的應用潛力。證明了L-天冬酰胺酶催化活性中心的柔韌度對比酶活有一定影響，其中的E22K與R111L突變株所得酶的比酶活分別提高了37%和31%，并且證明了位于α-螺旋上的92號位氨基酸對L-天冬酰胺酶的熱穩(wěn)定性有較大影響，將M92突變成A92能使其在85℃下的半衰期延長30 min。本研究對其他來源的L-天冬酰胺酶的改造具有相應的參考價值。