李云霞，馬生龍，聶瑩瑩，馬莉萍

（甘肅省科學(xué)院傳感技術(shù)研究所 甘肅省傳感器與傳感技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000）

近年來，食源性微生物中毒成為一個(gè)廣泛且日益嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題[1-2]。調(diào)查表明，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌是我國主要的食源性致病菌，由其引發(fā)的食物中毒平均發(fā)病率和病死率高，食品安全問題突出[3]。加強(qiáng)對(duì)有害病菌的檢測(cè)研究，從而及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的致病菌，是控制食品中病原菌污染和各類傳染病蔓延的根本措施[4]。目前，國內(nèi)外在食品中病原菌檢測(cè)時(shí)常用的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)生化培養(yǎng)檢測(cè)法、免疫學(xué)方法、探針雜交、PCR法等[5-8]，這些方法普遍存在速度慢或者假陽性率高的缺點(diǎn)，在相當(dāng)大的程度上限制了對(duì)其快速檢測(cè)和識(shí)別能力。因此，有必要建立起食源性致病菌的高通量、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)體系，以確保在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)正確判定食品的安全性，有效地預(yù)防和控制食源性疾病。

可視化視檢測(cè)技術(shù)[9-10]是一種新型技術(shù)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法不同，它可以將特定的分子結(jié)合轉(zhuǎn)變成可以直接通過肉眼觀察到的信號(hào)，擺脫普通檢測(cè)技術(shù)對(duì)專業(yè)人員和大型設(shè)備的依賴，具有快速、準(zhǔn)確、方便的特點(diǎn)，在致病菌檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景[11-13]。本研究中利用納米金結(jié)合銀染放大信號(hào)的方法，建立了一種可視化的食源性微生物快速檢測(cè)微陣列，實(shí)現(xiàn)對(duì)3種食源性微生物的可視化快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

沙門氏菌（21842）、金黃色葡萄球菌（10001）、志賀氏菌（10865）：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；納米金（自制）、醛基化玻片（自制）、吐溫20（Tween 20）、牛血清蛋白（BSA）、0.1 mol/L磷酸緩沖液（PB）（pH 7.2）、0.1 mol/L磷酸緩沖生理鹽水（PBS）、0.1 mol/L NaCl、0.2×洗液（SSC：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS）、0.03 mol/L NaCl、0.3 mmol/L C6H5Na3O7·2H2O）、對(duì)苯二酚、檸檬酸、檸檬酸三鈉、硝酸銀、DNA Marker、所需探針序列：由生工生物公司合成；核酸提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen）、PCR擴(kuò)增試劑盒：購自上海生工生物有限公司。

雜交液：45.5μL檢測(cè)探針，17.5μL 20×SSC，3 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS，5 mg硫酸葡聚糖，2μL去離子甲酰胺，32μL去離子水。

JEM-2100HR高分辨透射電鏡：日本電子公司產(chǎn) 品；Bio-Rad T100 PCR儀、Bio-Rad powerpac Unversal電泳儀、Bio-Rad ChemiDoc MP凝膠成像分析系統(tǒng)：美國伯樂公司產(chǎn)品；HZQ-FX全溫振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；EMS-20恒溫水浴鍋：金壇市宏凱儀器廠制造；島津紫外分光光度計(jì)：日本島津公司產(chǎn)品；Sartorius ST124分析天平：德國賽多利斯公司產(chǎn)品；H1650型離心機(jī)：湖南湘儀公司產(chǎn)品；微量移液器：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；DZF-6050真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠制造。

1.2 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成

在GenBank中獲取細(xì)菌核酸序列，找到沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因序列、志賀氏菌ipaH基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)與invA基因、nuc基因、ipaH基因序列兩端互補(bǔ)的特異性探針（氨基化修飾的基片探針，巰基化修飾的檢測(cè)探針）和PCR引物，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫在線Blast分析篩選。引物和探針均由上海生工生物有限公司合成。設(shè)計(jì)的探針和PCR引物見表1—2。

1.3 檢測(cè)探針的標(biāo)記

檢測(cè)探針標(biāo)記到納米金表面：取10 nmol/L粒徑為17 n的納米金溶液1 mL，以9 000 r/min離心40 min棄上清液，加入100μL去離子水重懸；加濃度為100μmol/L的檢測(cè)探針5μL，使總探針的終濃度達(dá)到5μmol/L，在室溫中放置過夜；之后分3次逐漸加入1 mol/L NaCl，0.1 mol/L PB（pH 7.2）至最終濃度分別為0.1 mol/L和10 mmol/L，充分混勻，室溫放置30 h；用0.01 mol/L PB（0.1 mol/L NaCl）溶液9 000 r/min離心40 min，清洗2次，棄上清液，再加100μL含有1 mol/L NaCl和0.1 mol/L PB（pH 7.2）的重懸液，于4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

表1 核酸探針序列表Table 1 List of nucleic acid probe sequences

表2 PCR引物序列Table 2 Sequences of PCR primers

1.4 微陣列的制備

將5個(gè)不同濃度（1 mmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L、100 pmol/L、1 pmol/L）氨基化探針點(diǎn)樣于醛基化基片的表面，點(diǎn)樣直徑100μm，點(diǎn)間距3 mm，點(diǎn)樣量0.1μL，每個(gè)濃度多次重復(fù)，水浴37℃固定18 h，經(jīng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL的BSA封閉未反應(yīng)的醛基，37℃水浴放置1 h，用0.1 mol/L的PBST（1×PBS+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫）清洗2次，每次3 min，干燥后備用。

1.5 細(xì)菌基因組DNA的提取和擴(kuò)增

快速提取細(xì)菌基因組DNA，用試劑盒提?。簩⒓?xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床培養(yǎng)12 h，取3 mL培養(yǎng)液3 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL進(jìn)行核酸提取，按DNA快速提取試劑盒說明書操作。

20μL PCR反應(yīng)體系：10×Taq Buffer含KCl 2μL，引物各0.5μL（100 umol/L），4種dNTP混合物各1μL（0.2 mmol/L），模板DNA 1μL（100μmol/L），1.5 mmol/L MgCl 1.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，加三蒸水至20μL。 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；經(jīng) 變 性（94℃，30 s），退 火（55℃，30 s），延 伸（72℃，30 s），35個(gè)循環(huán)；最后于72℃延伸5 min。

1.6 微陣列的雜交

在基片的每個(gè)點(diǎn)樣區(qū)滴加1μL雜交液，并將基片放置在保濕盒中，置于42℃水浴鍋中雜交2.5 h。清洗液（0.03 mol/L氯化鈉、0.3 mmol/L SSC、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS）預(yù)熱到42℃，輕輕沖洗芯片3次。ddH2O沖洗2次，氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.7 銀染

取350μL檸檬酸緩沖液，加入150μL對(duì)苯二酚（0.51 mol/L），再加入50μL AgNO3溶液，常溫避光銀染10 min，終止銀染反應(yīng)，用清水沖洗3次觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)探針的標(biāo)記

從圖1（a）中可見17 nm納米金顆粒均勻，界面清晰而且分散性良好；圖1（b）（c）（d）標(biāo)記探針的納米金可見周圍有一層物質(zhì)，納米金在一定范圍有聚集現(xiàn)象，表明探針已經(jīng)標(biāo)記到了納米金上。隨著探針的標(biāo)記，納米金粒徑增大，對(duì)應(yīng)的紫外吸收峰有向長(zhǎng)波段紅移的趨勢(shì)[14-15]；由圖1（e）可看出：標(biāo)記前納米金最大吸收峰值在521 nm;標(biāo)記沙門氏菌探針后最大吸收峰在528 nm;標(biāo)記金黃色葡萄球菌探針后的最大吸收峰在527 nm;標(biāo)記志賀氏菌探針后的最大吸收峰在525 nm，標(biāo)記了探針的納米金最大吸收峰波長(zhǎng)移動(dòng)了7 nm。這也說明核酸探針標(biāo)記到了納米金顆粒表面，使納米金粒子尺寸和形狀有所改變，改變了納米金的光譜特性[16]。

圖1 納米金及修飾后的3種檢測(cè)探針的TEM圖和紫外-可見光譜掃描圖Fig.1 Scanning results of AuNP probes with TEM and UV-Vis spectrum

2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取結(jié)果

將提取的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的基因組DNA，采用分度光度計(jì)對(duì)提取的DNA溶液純度、濃度進(jìn)行檢查，在1.5 g/dL瓊脂糖凝膠中，100 V電壓下，電泳時(shí)間30 min進(jìn)行電泳檢測(cè)，凝膠成像儀觀察分析，與標(biāo)記物（Marker）相比在6 500 bp附近有3條明亮條帶（見圖2）。

圖2 3種菌的基因組DNA電泳圖Fig.2 Salmonella、Staphylococcus aureus and Shigella DNA electrophoresis

2.3 細(xì)菌基因組DNA的PCR擴(kuò)增

通過查閱沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因、志賀氏菌ipaH基因的相關(guān)文獻(xiàn)，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中探針的位置，從表1中相對(duì)應(yīng)引物對(duì)3株致病菌株進(jìn)行擴(kuò)增。對(duì)沙門氏茵、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌PCR擴(kuò)增結(jié)果做凝膠電泳：1.5 g/dL瓊脂糖凝膠，100 V電壓，電泳時(shí)間25 min，凝膠成像儀觀察分析，1、2、3泳道分別得到長(zhǎng)度為425、280、312 bp左右目的片段，片段符合預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度。而且泳道亮度很強(qiáng)，說明擴(kuò)增產(chǎn)物較多（見圖3）。

圖3 沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌nuc基因序列和志賀氏菌ipaH基因PCR電泳圖Fig.3 Salmonella invA gene、Staphylococcus aureus nuc gene and Shigella ipaH gene PCR

2.4 微整列雜交

將檢測(cè)探針分別與基因組DNA（1 nmol/L）、PCR產(chǎn)物及特異靶序列在醛基化玻片上進(jìn)行雜交，銀染放大信號(hào)后呈現(xiàn)出肉眼可見的信號(hào)，見圖4。

圖4 特異靶序列、DNA及PCR銀染顯色Fig.4 Results of silver staining with specific target sequences，DNA and PCR

由實(shí)驗(yàn)可以看出檢測(cè)探針分別與基因組DNA、PCR產(chǎn)物及特異靶序列雜交，銀染顯色，三者的結(jié)果一致都顯示陽性，證明了提取的基因組DNA與檢測(cè)探針雜交、PCR產(chǎn)物與檢測(cè)探針雜交的方法都是可行的，但從操作的過程來講用提取的基因組DNA與檢測(cè)探針雜交銀染顯色，這一方法更簡(jiǎn)便快捷。

2.5 微陣列特異性實(shí)驗(yàn)

采用3種檢測(cè)探針分別與3種菌的基因組DNA做雜交實(shí)驗(yàn)，通過銀染放大信號(hào)，研究其特異性。

如圖5（a）為特異靶序列invA只與沙門氏菌基因組DNA有雜交結(jié)合，結(jié)果顯示陽性，而與金黃色葡萄球菌基因組DNA、志賀氏菌基因組DNA沒有雜交反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性；圖5（b）為特異靶序列nuc只和金黃色葡萄球菌基因組DNA有雜交結(jié)合顯示陽性結(jié)果，而與沙門氏菌、志賀氏菌DNA沒有雜交反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性；圖5（c）為特異靶序列ipaH只和志賀氏菌基因組DNA有雜交結(jié)合，顯示陽性，而與沙門氏菌、金黃色葡萄球菌DNA沒有雜交反應(yīng)，結(jié)果顯示陰性。表明該方法的檢測(cè)具有較高的特異性。

圖5 微陣列特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Specific experimental results of microarray substrate

2.6 微陣列靈敏度實(shí)驗(yàn)

將特異靶序列、基因組DNA（1 nmol/L）和PCR產(chǎn)物，使用UV-2550島津紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，稀釋原液配成5個(gè)不同濃度（1 mmol/L、100 nmol/L、1 nmol/L、100 pmol/L、1 pmol/L），進(jìn)行雜交顯色實(shí)驗(yàn)（見圖6）。

由實(shí)驗(yàn)可以看出在5種不同濃度下，檢測(cè)探針分別與基因組DNA、PCR產(chǎn)物及特異靶序列的雜交銀染，結(jié)果一致都顯示陽性，但隨著濃度的減小，陽性信號(hào)相應(yīng)的減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該微整列檢出限為1 mmol/L～1 pmol/L。

圖6 微陣列基片敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Sensitivity experimental results of microarray substrate

3結(jié)語

銀染信號(hào)放大技術(shù)已在致病菌的檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用，其有效提高了檢測(cè)靈敏度。李向麗等[17]采用納米金標(biāo)記結(jié)合銀染信號(hào)放大技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)福氏志賀氏菌的檢測(cè)，銀染后檢測(cè)信號(hào)增強(qiáng)了上萬倍，對(duì)目標(biāo)菌DNA檢測(cè)限達(dá)2 fmol/L。劉小蘭等[18]將PCR擴(kuò)增的金黃色葡萄球菌nuc基因與生物素探針、納米金探針形成的三明治結(jié)構(gòu)固定在已包被鏈霉親和素的微孔板上，然后在低溫下逐步銀染顯色，從而放大檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)靈敏度為1 pmol/L。

作者通過銀染放大信號(hào)技術(shù)，建立了一種同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的可視化微陣列，為3種食源性微生物的檢測(cè)提供了快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法。首先對(duì)invA基因序列、nuc基因序列、ipaH基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，分別得到425、280、312 bp左右PCR產(chǎn)物。通過比較檢測(cè)探針與基因組DNA、PCR產(chǎn)物及特異靶序列的雜交銀染，目標(biāo)菌都顯示了陽性，非目標(biāo)菌顯示陰性。在微陣列特異性實(shí)驗(yàn)中，基因組DNA跟設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)檢測(cè)探針雜交結(jié)果顯示陽性，跟其他菌檢測(cè)探針不雜交，結(jié)果顯示陰性，證明了該方法具有特異性。在微陣列靈敏性實(shí)驗(yàn)中，檢測(cè)探針分別與基因組DNA、PCR產(chǎn)物及特異靶序列雜交時(shí)，在1 mmol/L～1 pmol/L濃度范圍內(nèi)，銀染結(jié)果肉眼清晰可見。通過上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較，證明作者建立的可視化核酸微陣列檢測(cè)食源性微生物的方法是成功的。

作者建立的可視化核酸微陣列對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，實(shí)用性強(qiáng)，擺脫了基因芯片在雜交結(jié)果分析階段對(duì)熒光掃描儀的依賴，雜交結(jié)果明顯直觀。為食源性致病菌的檢驗(yàn)提供了新的思路和方法，可在基層或偏遠(yuǎn)地區(qū)的快速初篩領(lǐng)域推廣應(yīng)用。