范智義，李 恒*，2，張其圣，2，陳 功，2，李潔芝，鄧維琴，陳相杰

（1.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院 泡菜與調(diào)味品研究所，四川 成都611130；2.四川東坡中國(guó)泡菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 眉山620000）

關(guān)鍵字：郫縣豆瓣；生香酵母；菌株篩選；酵母生長(zhǎng)特性

郫縣豆瓣是我國(guó)西南地區(qū)一種特色發(fā)酵蠶豆醬，以其味辣香醇、紅棕油亮、瓣粒酥脆、黏稠絨實(shí)、醬香濃郁[1]的特點(diǎn)為人所知，在烹飪與食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。郫縣豆瓣的制作可大致分為甜瓣子發(fā)酵、辣椒醅發(fā)酵和混合后熟3個(gè)部分[1]。在郫縣豆瓣的甜瓣子發(fā)酵和混合后熟中，制曲時(shí)所產(chǎn)生的酶、微生物的代謝以及各類(lèi)化學(xué)反應(yīng)共同作用，水解原料中大分子物質(zhì)的同時(shí)生成各類(lèi)呈色、呈味和呈香物質(zhì)，對(duì)郫縣豆瓣產(chǎn)品質(zhì)量有著重要的影響。因此，改進(jìn)豆瓣醬發(fā)酵工藝、提高發(fā)酵質(zhì)量對(duì)高品質(zhì)郫縣豆瓣的生產(chǎn)具有重要意義。

酵母是傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品釀造中常見(jiàn)的一類(lèi)生香微生物，酵母代謝過(guò)程中可產(chǎn)生醇[2]、酯[3]、酚[4]以及呋喃化合物[5]等多種揮發(fā)性風(fēng)味成分，有助于發(fā)酵調(diào)味品風(fēng)味的形成。在傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品生產(chǎn)領(lǐng)域，技術(shù)人員利用生香酵母強(qiáng)化發(fā)酵，可起到縮短發(fā)酵周期、提高質(zhì)量穩(wěn)定性、改善產(chǎn)品風(fēng)味的效果。在現(xiàn)代醬油生產(chǎn)中，生香酵母的添加已成為標(biāo)準(zhǔn)釀制工藝的一部分[6]。

郫縣豆瓣作為一種富有特色的傳統(tǒng)調(diào)味品，其發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味的形成也離不開(kāi)酵母菌的代謝生香。目前，人們?cè)谯h豆瓣中發(fā)現(xiàn)了多種酵母[7]，對(duì)這些酵母的研究和應(yīng)用逐漸受到了的關(guān)注。楊倩等[8]從郫縣豆瓣中篩選出了一株可耐受26%氯化鈉的魯氏接合酵母，其能產(chǎn)生苯乙醇等多種發(fā)酵醬特征性風(fēng)味物質(zhì)；劉超蘭等[9]在郫縣豆瓣后熟階段向物料中接種了乳酸菌（3×106CFU/g）和酵母菌（1×106CFU/g），明顯增加了產(chǎn)品中的揮發(fā)性酯類(lèi)和多種氨基酸的含量，縮短了陳釀時(shí)間；楊松彰等[10]將多種乳酸菌和耐鹽酵母復(fù)配后用于郫縣豆瓣強(qiáng)化發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量明顯提高。盡管如此，對(duì)郫縣豆瓣中產(chǎn)香酵母的篩選仍缺乏整體系統(tǒng)的研究，郫縣豆瓣的生產(chǎn)大多仍依賴(lài)于粗放的自然接種。作者從傳統(tǒng)郫縣豆瓣中篩選出一株具有生香能力的酵母菌株，并研究了該酵母菌株在不同食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和溫度下的生長(zhǎng)特性，以期為郫縣豆瓣酵母菌菌種資源的挖掘與利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

郫縣豆瓣分別于2017年和2018年的7～9月采集自成都市郫都區(qū)某企業(yè)，該企業(yè)郫縣豆瓣采用傳統(tǒng)工藝，依賴(lài)自然接種進(jìn)行發(fā)酵和后熟。樣品在水泥條池后熟發(fā)酵約1個(gè)月后收集，裝于無(wú)菌采樣袋，-4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

4-甲基-2-戊醇（色譜純）：Sigma公司產(chǎn)品；甲醇（色譜純）：重慶川東化工公司產(chǎn)品；其余分析純?cè)噭嘿?gòu)于成都科隆化學(xué)制公司。2.5 L AnaeroGen培養(yǎng)袋、密封培養(yǎng)罐：Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒：上海生工公司產(chǎn)品；YM培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、麥芽浸粉、瓊脂粉：青島海博公司產(chǎn)品；酵母蛋白胨、酵母浸粉：安琪酵母公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)：上海儀電公司產(chǎn)品；Eclipse E100光學(xué)顯微鏡：尼康儀器公司產(chǎn)品；GCMS-TQ8040氣質(zhì)聯(lián)用儀：島津公司產(chǎn)品；Agilent J&W DB-WAX高分離度氣相色譜柱（30 m×0.320 mm×0.25μm）：安捷倫公司產(chǎn)品；固相微萃取手柄（帶有50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纖維）：Supelco公司產(chǎn)品。

1.3 郫縣豆瓣中酵母菌的分離與鑒定

稱(chēng)取樣品25 g，無(wú)菌水10倍稀釋?zhuān)捎靡韵路椒ǚ蛛x樣品中的酵母菌：方法一，取1 mL樣品稀釋液于培養(yǎng)皿，傾注含質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%氯化鈉的YM瓊脂培養(yǎng)基，混勻后凝固，30℃厭氧培養(yǎng)；方法二，取1 mL樣品稀釋液于培養(yǎng)皿，傾注PDA固體培養(yǎng)基，混勻后凝固，30℃好氧培養(yǎng)。

挑取培養(yǎng)皿上單菌落，相應(yīng)液體培養(yǎng)基擴(kuò)培后提取菌體基因組DNA，送至成都擎科生物科技公司擴(kuò)增18S rDNA后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，確定酵母種屬。

1.4 酵母產(chǎn)醇能力分析

酵母菌產(chǎn)醇能力測(cè)定參考Zoecklein等[11]的方法，并做簡(jiǎn)化。各酵母菌株以1×106個(gè)/mL接種于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%氯化鈉的YM培養(yǎng)基中，30℃密封靜置培養(yǎng)6 d。取適當(dāng)稀釋培養(yǎng)液1 mL與2 mL質(zhì)量濃度為2 g/dL的重鉻酸鉀溶液、1 mL濃硫酸混勻，60℃密封反應(yīng)30 min，610 nm測(cè)定吸光度。代入乙醇梯度稀釋液，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算培養(yǎng)液醇的相對(duì)含量，以相當(dāng)于乙醇的體積分?jǐn)?shù)（%）表示。

1.5 酵母產(chǎn)香能力分析

依照1.4節(jié)所述制備酵母培養(yǎng)液，搖勻取2 mL于15 mL固相微萃取瓶，滴加2μL 0.5μg/mL的4-甲基-2-戊醇溶液作為內(nèi)標(biāo)物，混勻后60℃預(yù)熱2 min，固相微萃取纖維60℃恒溫吸附50 min。

萃取完畢后，將固相微萃取纖維插入氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣孔，氣相色譜分析以氦氣為載氣，柱流量0.93 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度250℃。柱箱初始溫度50℃，程序開(kāi)始后10℃/min升溫至85℃，保持1.5 min；5℃/min升溫至100℃，保持1 min；2.5℃/min升溫至175℃，保持1.5 min；10℃/min升溫至250℃，保持2 min。質(zhì)譜離子源溫度230℃，質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為35.0～350.0，電子轟擊能量70 eV，檢測(cè)器電壓0.1 kV。揮發(fā)性成分的鑒定利用NIST05譜庫(kù)檢索結(jié)果與人工圖譜解析共同確定。質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.6 培養(yǎng)基氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH和培養(yǎng)溫度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

分別配制氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%的YM培養(yǎng)液，pH值為2、3、4、6、8、9、10的YM培養(yǎng)液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%氯化鈉），接入1×104個(gè)/mL酵母菌，30℃靜置培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)溫度的研究中，將接入1×104個(gè)/mL酵母菌的YM培養(yǎng)液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氯化鈉）置于4、10、20、30、37、40℃的條件下培養(yǎng)。

培養(yǎng)開(kāi)始后，每隔一定時(shí)間取2 mL搖勻的培養(yǎng)液，620 nm測(cè)定吸光度。酵母生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，搖勻培養(yǎng)液，使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

以上所有指標(biāo)均進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn)，取平均值。采用Tukey法對(duì)組間數(shù)據(jù)差異的顯著性進(jìn)行檢驗(yàn)（P＜0.05），使用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 郫縣豆瓣醬中酵母的分離與鑒定

經(jīng)高鹽兼性厭氧和無(wú)鹽好氧2種分離方法，從郫縣豆瓣中共獲得28株酵母，10株（編號(hào)BP01～10）通過(guò)方法一獲得，18株（編號(hào)BP11～28）通過(guò)方法二獲得（表1）。所有酵母菌株中，17株為魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii），占所獲菌株的大部分，3株酵母菌屬于接合酵母屬（Zygosaccharomyces），但未鑒定到種，其余8株分屬奧默柯達(dá)酵母（Kodamaea ohmeri）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、 庫(kù) 德 里 阿 茲 威 氏 畢 赤 酵 母（Pichia kudriavzevii）和 伯 頓 絲 孢 畢 赤 酵 母（Hyphopichia burtonii）。魯氏接合酵母菌株多采用高鹽兼性厭氧培養(yǎng)分離得到，其余種類(lèi)的酵母則是通過(guò)無(wú)鹽好氧方法分離得到的。

表1 郫縣豆瓣中分離獲得的酵母菌菌株編號(hào)、形態(tài)特征和種屬Table 1 Identification numbers,morphological characters and species of strains isolated from Pixian bean paste

續(xù)表1

魯氏接合酵母是郫縣豆瓣、黃豆醬及其他種類(lèi)蠶豆醬發(fā)酵、后熟中最主要的酵母菌之一[7,12-13]。高鹽厭氧環(huán)境模擬了郫縣豆瓣發(fā)酵時(shí)醬醅內(nèi)部的狀態(tài)，利用該方法分離得到的魯氏接合酵母菌株在郫縣豆瓣醬醅中可能也有較強(qiáng)活性，并在風(fēng)味形成中發(fā)揮著作用。釀酒酵母是面包制作和釀酒中常見(jiàn)的酵母[14]，而庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母、奧默柯達(dá)酵母和伯頓絲孢畢赤酵母在食品中較少被報(bào)道。利用無(wú)鹽好氧方法分離得到酵母菌種類(lèi)相對(duì)豐富，但高鹽兼性厭氧分離方法卻并未獲得這些菌株，說(shuō)明其在高滲、低氧的條件下生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，可能不是發(fā)酵過(guò)程中主要的酵母菌。

2.2 酵母產(chǎn)醇能力分析

30℃培養(yǎng)5 d后，接種各酵母菌株的培養(yǎng)液中的醇相對(duì)含量如圖1所示。魯氏接合酵母及接合酵母屬菌株培養(yǎng)液中的醇相對(duì)含量均在0.9%以上，而其他種屬酵母的產(chǎn)醇能力較弱，培養(yǎng)液醇相對(duì)含量均低于0.6%，這有可能是由于其耐鹽性差，在高鹽培養(yǎng)液中生長(zhǎng)受抑導(dǎo)致的。所有試驗(yàn)組中，接種菌株BP02、BP20、BP05、BP04、BP08、BP03、BP10和BP01的培養(yǎng)液醇相對(duì)含量均在1.06%以上，產(chǎn)醇能力較強(qiáng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取這些菌株做進(jìn)一步研究。

圖1 各酵母菌株培養(yǎng)液中的醇相對(duì)含量（以乙醇的體積分?jǐn)?shù)計(jì)）Fig.1 Alcohol contents in culture broths of different yeast strains(expressed as ethanol volume fraction)

2.3 酵母菌產(chǎn)香能力分析

各酵母菌株于30℃培養(yǎng)5 d后，與空白組培養(yǎng)液相比，接種酵母菌株的培養(yǎng)液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（見(jiàn)圖2），其主要揮發(fā)性物質(zhì)包括醇、酯、酸、酮、酚、醛六大類(lèi)。其中，醇類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，各菌株培養(yǎng)液中的醇類(lèi)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在17 ng/g以上，占揮發(fā)性物質(zhì)的絕大部分，醇類(lèi)物質(zhì)以苯乙醇、乙醇和3-甲基丁醇為主（數(shù)據(jù)未展示）；酯類(lèi)物質(zhì)為第二大揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其在各組中質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.23～2.99 ng/g之間，以菌株BP02和BP20培養(yǎng)液中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，均在2.8 ng/g以上；酸、酮、酚、醛在各菌株培養(yǎng)液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)極少，均不超過(guò)0.7 ng/g。所有酵母菌株培養(yǎng)液中，BP02的醇、酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，產(chǎn)香能力較優(yōu)。

圖2 培養(yǎng)5 d后各酵母菌株培養(yǎng)液中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Fig.2 Contents of volatile compounds in culture broths of different yeast strains after 5 d incubation

根據(jù)各酵母菌株的產(chǎn)醇、產(chǎn)香能力，選取魯氏接合酵母菌株BP02進(jìn)行后續(xù)研究。BP02菌落呈現(xiàn)白色圓形，菌落表面干燥，易于挑起（見(jiàn)圖3（a））。挑取菌落鏡檢，可觀察到球形或橢球形細(xì)胞，并存在明顯的出芽現(xiàn)象（見(jiàn)圖3（b））。

圖3 魯氏接合酵母BP02的菌落和細(xì)胞形態(tài)Fig.3 Colonial and cellular morphology of Zygosaccharomyces rouxii BP02

2.4 氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)魯氏接合酵母BP02生長(zhǎng)的影響

圖4為魯氏接合酵母BP02在不同氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的YM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及穩(wěn)定期細(xì)胞計(jì)數(shù)。隨著培養(yǎng)基氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，BP02菌株延滯期時(shí)間先減后增，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率及穩(wěn)定期培養(yǎng)液吸光度則呈現(xiàn)先增后減的特點(diǎn)。培養(yǎng)基氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，BP02菌株的延滯期最短，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率最大，穩(wěn)定期培養(yǎng)液吸光度最高，生長(zhǎng)最旺盛。氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于25%時(shí)，BP02菌株培養(yǎng)期間吸光度始終在0.1以下。氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0%～25%范圍內(nèi)，BP02菌株穩(wěn)定期細(xì)胞密度均在1×107個(gè)/mL以上，其中氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的試驗(yàn)組穩(wěn)定期細(xì)胞密度最大，達(dá)2.78×108個(gè)/mL，但在氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～25%的范圍內(nèi)各組穩(wěn)定期細(xì)胞密度差異不顯著?？傮w來(lái)看，BP02菌株具有較強(qiáng)的耐鹽性，可耐受最高含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%氯化鈉的培養(yǎng)環(huán)境。

圖4 魯氏接合酵母BP02在含不同氯化鈉培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線及穩(wěn)定期細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.4 Growth curves and cell counts of Zygosaccharomyces rouxii BP02 cultured in sodium chloridewith different concentrations

魯氏接合酵母是一種典型的耐鹽酵母菌，Jansen等[15]的研究表明魯氏接合酵母可在培養(yǎng)基氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%～18%范圍內(nèi)均可旺盛生長(zhǎng)。本研究中，培養(yǎng)液氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0%～20%時(shí)，魯氏接合酵母BP02的生長(zhǎng)速率雖有所不同，但穩(wěn)定期細(xì)胞密度基本一致，培養(yǎng)液氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%和30%時(shí)，雖然在培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液吸光度未發(fā)生明顯改變，但細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與初始接種密度1×104個(gè)/mL相比，25%和30%氯化鈉組的細(xì)胞密度明顯增加，說(shuō)明在極高質(zhì)量分?jǐn)?shù)氯化鈉的培養(yǎng)環(huán)境中，魯氏接合酵母BP02仍可緩慢生長(zhǎng)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室之前的研究，郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵階段的氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在14%，后熟階段豆瓣醬的氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)則在18%左右，因此，魯氏接合酵母BP02可較好適應(yīng)郫縣豆瓣發(fā)酵過(guò)程中的高鹽環(huán)境。

2.5 pH對(duì)魯氏接合酵母BP02生長(zhǎng)的影響

圖5為魯氏接合酵母BP02在不同pH YM培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線及穩(wěn)定期細(xì)胞計(jì)數(shù)。可以看出，菌株BP02可在pH值為3～8的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，在此范圍內(nèi)，菌株BP02的延滯期呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì)；在pH值為4和6時(shí)，相對(duì)于其他試驗(yàn)組，BP02菌株的延滯期最短，生長(zhǎng)最迅速，穩(wěn)定期細(xì)胞密度均在1×108個(gè)/mL以上，二者生長(zhǎng)曲線幾乎完全重合，表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)特性；pH值為3時(shí)，BP02菌株的延滯期增加，穩(wěn)定期培養(yǎng)液吸光度和細(xì)胞密度也顯著下降，而培養(yǎng)基pH值為8時(shí)，BP02菌株的延滯期明顯延長(zhǎng)，但穩(wěn)定期培養(yǎng)液吸光度和細(xì)胞密度較pH值為4和6的試驗(yàn)組沒(méi)有明顯差異。

圖5 不同pH下魯氏接合酵母BP02的生長(zhǎng)曲線及穩(wěn)定期細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.5 Growth curves and cell count of Zygosaccharomyces rouxii BP02 cultured in different pH

魯氏接合酵母可適應(yīng)廣泛的pH培養(yǎng)環(huán)境，據(jù)Restaino等[16]報(bào)道，魯氏接合酵母在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%葡萄糖的培養(yǎng)基中可在pH值為1.5～10.5的環(huán)境下生長(zhǎng)，其最適生長(zhǎng)pH值為3.5～5.5；ONishi等[16]的研究則表明，無(wú)鹽條件下魯氏接合酵母可在pH值為3～7的條件下生長(zhǎng)，而在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%氯化鈉的培養(yǎng)環(huán)境中其生長(zhǎng)pH值為4～5。pH對(duì)魯氏接合酵母生長(zhǎng)的影響可能與培養(yǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)成分密切相關(guān)，但可以明確的是，在pH值為4～6的弱酸性環(huán)境中生長(zhǎng)情況最好，這與Yong等[17]的研究結(jié)果相一致。郫縣豆瓣甜瓣子發(fā)酵過(guò)程中，醬醅的pH值由初始的6.0～6.5下降到發(fā)酵后期的4.0～4.5，并在后熟中維持穩(wěn)定，整個(gè)發(fā)酵、后熟過(guò)程的pH環(huán)境均有利于魯氏接合酵母BP02的生長(zhǎng)。

2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)魯氏接合酵母BP02生長(zhǎng)的影響

圖6為魯氏接合酵母BP02菌株在不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)曲線及穩(wěn)定期細(xì)胞計(jì)數(shù)?？梢钥闯觯S著培養(yǎng)溫度的上升，BP02菌株的延滯期逐漸縮短，但在10～30℃，各試驗(yàn)組穩(wěn)定期培養(yǎng)液吸光度和細(xì)胞密度無(wú)顯著差異，培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，魯氏接合酵母BP02對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率最快，但穩(wěn)定期培養(yǎng)液吸光度和細(xì)胞計(jì)數(shù)較10～30℃各組顯著降低；培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，BP02菌株的生長(zhǎng)最為旺盛，但培養(yǎng)溫度為4℃時(shí)，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中BP02菌株幾乎不生長(zhǎng)。

圖6 不同溫度下魯氏接合酵母BP02的生長(zhǎng)曲線及穩(wěn)定期細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.6 Growth curves and cell counts of Zygosaccharomyces rouxii BP02 cultured in different temperatures

VAN uden等研究了溫度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響后認(rèn)為，當(dāng)溫度高于一定值后，酵母菌的熱死亡會(huì)成為影響比增長(zhǎng)速率的因素之一，同時(shí)存活的細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗也會(huì)增加，導(dǎo)致穩(wěn)定期酵母得率的減少。由此可以推測(cè)，隨著培養(yǎng)溫度的升高，魯氏接合酵母BP02的比增長(zhǎng)速率提高，但當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，由于比死亡速率的增加小于比增長(zhǎng)速率的增加，相對(duì)于30℃酵母菌的對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率仍有所提高，但酵母對(duì)葡萄糖消耗的增加，用于增殖的營(yíng)養(yǎng)相對(duì)減少，37℃環(huán)境下BP02穩(wěn)定期細(xì)胞計(jì)數(shù)及吸光度較30℃培養(yǎng)條件均有所降低，與本研究一致。Yong等[17]報(bào)道稱(chēng)37℃魯氏接合酵母的生長(zhǎng)速率較室溫（28℃）快，但穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)量則低于室溫培養(yǎng)的魯氏接合酵母。實(shí)際生產(chǎn)中，短時(shí)間發(fā)酵（3個(gè)月內(nèi)）的甜瓣子在發(fā)酵時(shí)會(huì)控制溫度在30～35℃，而長(zhǎng)時(shí)間（1年以上）發(fā)酵的甜瓣子及后熟過(guò)程一般在常溫下進(jìn)行。從魯氏接合酵母BP02的生長(zhǎng)特性來(lái)看，在強(qiáng)化發(fā)酵時(shí)及后熟時(shí)將溫度控制在合理的范圍，可促進(jìn)其快速增殖，有利于產(chǎn)品風(fēng)味的形成。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究中通過(guò)無(wú)鹽好氧和高鹽兼性厭氧2種方法，從傳統(tǒng)郫縣豆瓣中分離得到了28株酵母菌，主要為魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii），也分離得到了奧默柯達(dá)酵母（Kodamaea ohmeri）、庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和伯頓絲孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）等。通過(guò)產(chǎn)醇試驗(yàn)可知，魯氏接合酵母在高鹽培養(yǎng)條件下產(chǎn)醇能力較強(qiáng)，而其他酵母的耐鹽性較差，產(chǎn)醇能力弱。經(jīng)過(guò)產(chǎn)醇與產(chǎn)香試驗(yàn)，從分離獲得的酵母菌株中篩選出了風(fēng)味生成能力較強(qiáng)的魯氏接合酵母BP02。經(jīng)研究，該菌株最高可耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的氯化鈉，在pH值為3～8、10～37℃均可生長(zhǎng)。其在氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、pH值為4～6、30℃的培養(yǎng)環(huán)境中生長(zhǎng)最旺盛?？傮w來(lái)看，魯氏接合酵母是郫縣豆瓣中最主要的酵母菌，并具有一定的生香能力。本研究中篩選出的產(chǎn)香魯氏接合酵母BP02在高鹽、弱酸和中溫的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)良好，該生長(zhǎng)條件與郫縣豆瓣發(fā)酵體系相一致，說(shuō)明菌株BP02高度適應(yīng)郫縣豆瓣醬醅環(huán)境，可作為強(qiáng)化菌種用于提高郫縣豆瓣的風(fēng)味品質(zhì)。