劉圓月 侯菊花 李燦
[摘要]目的探討KLF6在口腔癌細胞惡性生長中的作用機制。方法應用免疫組化法檢測95例口腔鱗癌組織和95例正常口腔黏膜組織中KLF6、p21和cyclinD1的表達。結(jié)果KLF6、p21,和cyclinD1在口腔鱗癌與正??谇火つそM織之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);KLF6與p21的表達存在正相關(guān),與cyclinD1表達存在負相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論KLF6基因在口腔鱗癌的發(fā)生起著作用,KLF6與組織分化的關(guān)系提示漿表達的KLF6可用于判定腫瘤患者預后,而p21和cyclinD1可能是作用的兩個靶點。
[關(guān)鍵詞]KLF6;口腔癌細胞;作用機制;實驗研究
[中圖分類號]R78 [文獻標識碼]A [文章編號]1674-4721(2012)12(a)-0092-02
在世界范圍,口腔鱗狀細胞癌(OSCC)為一種常見的口腔癌[1],盡管醫(yī)療技術(shù)取得了巨大進步,但口腔癌的預后仍然不夠理想。最近研究表明,癌發(fā)病的過程包括細胞增殖加速,細胞凋亡減弱,凋亡失敗等。KLF6是普遍表達的鋅指轉(zhuǎn)錄因子,它與生長發(fā)育、細胞分化及生長相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導,細胞增殖、凋亡、血管生成等都有關(guān)。本文旨在研究KLF6是否與口腔癌的發(fā)生相關(guān),并探究其與p21和cyclinD1蛋白的關(guān)系。
1資料與方法
1.1一般資料
從本院2009年12月~2012年4月口腔鱗狀細胞癌患者中,隨機選95例作研究組,男65例,女30例,年齡37~75歲,平均52.8歲;術(shù)前均未經(jīng)任何放、化療等治療;其中,舌39例,口底27例,牙齦9例,頰13例,硬腭7例;臨床分期:Ⅰ期39例,Ⅱ期27例,Ⅲ期15例,Ⅳ期14例;頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例,無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者63例。取每例標本腫瘤邊緣5mm外的癌旁正??谇火つ?5例(均未見腫瘤組織)為對照,其中,舌39例,口底27例,牙齦9例,頰13例,硬腭7例。
1.2實驗方法
1.2.1主要試劑與染色方法 兔抗人cyclinD1單克隆抗體購于福州邁新生物技術(shù)有限公司,鼠抗人p21蛋白單克隆抗體,多克隆兔抗KLF6均購自SantaCruz公司。以上病理組織標本均經(jīng)甲醛溶液固定、石蠟包埋,制成4μm厚切片。進行免疫組織染色,以PBS替代一抗作為陰性對照。
1.2.2結(jié)果判斷 在高倍鏡下對著色反應作如下評分:無著色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;陽性范圍:<5%為0分,5%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~100%為3分;兩項結(jié)果相加,0~1分為陰性(-)、2~7分為陽性(+)。
1.3統(tǒng)計學方法
應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件,計量資料采用t檢驗,計數(shù)資料采用卡方檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2結(jié)果
2.1KLF6、p21、cyclinD1在口腔癌組與對照組的表達
KLF6蛋白在細胞核和細胞漿均有呈黃色或棕色表達;p21及cyclinD1蛋白主要在細胞核呈現(xiàn)黃色或棕色表達,cyclinD1在口腔癌組的陽性表達顯著高于對照組(P<0.05),而KLF6、p21在對照組的陽性表達高于口腔癌組(P<0.05),見表1。
2.2KLF6,p21,cyclinD1與口腔鱗癌臨床病理學關(guān)系
KLF6在不同組織分化組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);但KLF6在不同年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);p21在不同組織分化組表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);但p21在不同年齡、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。cyclinD1在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,臨床分期組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而在不同年齡、組織分化組的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。
2.3KLF6、p21、cyclinD1三者表達的相關(guān)性
KLF6與p21的表達存在正相關(guān),與cyclinD1表達存在負相關(guān)(P<0.05),見表3。
3討論
研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤細胞都存在一些細胞周期調(diào)控因子的表達異常,哺乳動物細胞分裂及分化的主要調(diào)節(jié)事件發(fā)生在G1期,G1期周期蛋白異常表達可能導致細胞周期失調(diào),導致腫瘤的發(fā)生[2]。
p21屬于細胞周期依賴激酶抑制物,主要通過阻止視網(wǎng)膜母細胞瘤(Rb)基因的磷酸化來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性。當Rb基因處于磷酸化狀態(tài)時,調(diào)節(jié)細胞周期進展的一些關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄不可以被E2F激活。以此,p21阻止了G1期向S期的過渡,將細胞周期阻滯在G1~S期,從而抑制細胞的生長。蔡楊等[3]推測p21基因失活是口腔癌發(fā)生過程中的早期分子事件。cyclinD1也被認為是在細胞周期蛋白家族中限制G1期向S期轉(zhuǎn)化中重要的調(diào)控因子之一。該基因的擴增、染色體重排或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)都可導致其蛋白的過表達而發(fā)生癌變,cyclinD1的N端的序列可與Rb結(jié)合,在CDK4的協(xié)助下,使Rb蛋白被磷酸化,總之,cyclinD1的基因擴增和過表達可導致高磷酸化的Rb,從而促進G1/S期轉(zhuǎn)化,加速細胞周期,使細胞持續(xù)增殖導致惡性轉(zhuǎn)化[4],因此,p21與cyclinD1均是口腔癌發(fā)生的關(guān)鍵蛋白。
有研究[5-6]報道KLF6與前列腺癌、肝癌的發(fā)生有密切關(guān)系。KLF6主要通過抑制腫瘤細胞的增殖以及促凋亡發(fā)生作用,除此外它的表達還與體內(nèi)一氧化氮的合成相關(guān),可使細胞內(nèi)源性一氧化氮合酶的mRNA的表達增加3~4倍,TGF-β1和TGF-βⅠ、Ⅱ型受體以及HSP47、誘生型一氧化氮合酶等也是KLF6的靶基因。這些靶點都可以參與機體的細胞周期調(diào)控、細胞凋亡等多種生物學行為[7-8],以上均說明KLF6對腫瘤的抑制功能。本實驗結(jié)果顯示,KLF6與口腔癌相關(guān)??谇话㎏LF6的表達高于對照組,且隨著細胞分化程度降低,細胞增殖能力增強以及細胞惡性程度增加,異常的KLF6大量增加出現(xiàn)在細胞漿中,提示漿表達的KLF6可作為判定腫瘤惡性程度的指標。有研究發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性可增加KLF6基因選擇性剪切的發(fā)生,產(chǎn)生的變異體如KLF6-SV1及KLF6-SV2等可影響p21的表達,因此在胞質(zhì)中競爭轉(zhuǎn)錄輔助因子或隔離野生型KLF6,以此對抗野生型KLF6對生長的抑制,SirachE等[9]研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞株中,KLF6通過p21阻止Rb基因磷酸化,下調(diào)細胞周期蛋白cyclinD1,從而干擾細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化,使腫瘤細胞的生長抑制,本次研究發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤中KLF6基因核表達缺失或減弱與p21表達下調(diào)呈顯著正相關(guān),正常組織KLF6表達cyclinD1表達顯著負相關(guān)也支持以上結(jié)論。因此,筆者推測KLF6的功能是通過上調(diào)p21蛋白的表達及對cyclinD1的抑制而發(fā)揮作用??傊?,KLF6與口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),p21及cyclinD1可能是KLF6作用的其中兩個靶點,具體機制值得進一步深入研究。
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(收稿日期:2012-07-13 本文編輯:林利利)