萬 東，?；埒P，羅 勇，謝 鵬

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.急診醫(yī)學(xué)科＆重癥醫(yī)學(xué)科、3.神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016;2.西南大學(xué)藥學(xué)院暨中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400716)

缺血性腦卒中后梗死灶周圍大腦皮質(zhì)(peri-infarct cortex，PIC)軸突芽生(axonal sprouting)是具有代表性的神經(jīng)修復(fù)事件。芽生軸突可形成新的功能性突觸連接，即突觸新生(synaptogenesis)，參與卒中后神經(jīng)環(huán)路重構(gòu)，奠定功能恢復(fù)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此，以PIC區(qū)軸突芽生和突觸新生為研究切入點(diǎn)，可望篩選出有效促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)修復(fù)的藥物或治療手段。

梓醇是地黃的主要活性成分，具有確切的腦保護(hù)作用和促神經(jīng)修復(fù)效應(yīng)。課題組及國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)［1－4］，梓醇可促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，改善腦卒中大鼠神經(jīng)缺失功能恢復(fù)狀況。但梓醇能否促進(jìn)芽生軸突形成新的突觸終末尚不明確。因此，本研究制備大鼠大腦中動(dòng)脈永久性閉塞模型，采用生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth associated protein-43，GAP-43)標(biāo)記芽生軸突，突觸素(synaptophysin，P38)標(biāo)記突觸前終末，激光共聚焦檢測(cè)PIC區(qū)GAP-43和P38共定位信號(hào)，觀察梓醇對(duì)PIC區(qū)芽生軸突形成突觸的影響;進(jìn)一步采用透射電鏡結(jié)合體視學(xué)方法檢測(cè)PIC區(qū)突觸數(shù)密度(number density，Nv)和面密度(sarface density，Sv)，觀察梓醇對(duì)突觸重構(gòu)的影響。通過上述研究，以期為明確回答梓醇能否促進(jìn)有效軸突芽生，能否增強(qiáng)突觸新生及突觸重構(gòu)能力等問題提供直接的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組36只成年健康Sprague-Dawley大鼠，♀♂不拘，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào):檢動(dòng)字2002A040)。隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=6)，模型組(n=6)，生理鹽水組(n=6)，梓醇低劑量組(n=3)、中劑量組(n=6)、高劑量組(n=3)和胞磷膽堿組(陽性藥物對(duì)照組，n=6)。

1.2 藥品與器材梓醇購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(產(chǎn)品批號(hào):110808-200508，規(guī)格:20 mg/支)，胞磷膽堿鈉注射液為山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品(國(guó)藥準(zhǔn)字 H14021994，規(guī)格:125 g·L－1)。小鼠抗突觸素(P38)單克隆抗體、兔抗GAP-43多克隆抗體、Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。Leicacm1850型冰凍切片機(jī)、TCS SP2型激光共聚焦掃描顯微鏡和Leica-EM UC7超薄切片機(jī)均為德國(guó)徠卡公司產(chǎn)品，H7500型透射電子顯微鏡為日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 模型制備右顳側(cè)低位開顱，電凝大腦中動(dòng)脈位于嗅束與大腦下靜脈之間的一段，制備局灶永久性腦缺血模型。假手術(shù)組除不凝閉右側(cè)大腦中動(dòng)脈外，其余步驟與模型組相同。術(shù)中保持直腸溫度在36.5℃ ～37.5℃。

1.4 模型成功的判斷與納入標(biāo)準(zhǔn)術(shù)后24 h，采用Bederson評(píng)分評(píng)估受累肢體神經(jīng)缺失功能狀況:0分，無神經(jīng)功能缺失癥狀;1分，左前肢屈曲，但不伴其他異常，即提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽性;2分，提尾懸空實(shí)驗(yàn)陽性，同時(shí)側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)向推力實(shí)驗(yàn)陽性)，但自由活動(dòng)時(shí)無轉(zhuǎn)圈行為;3分，同2分行為，且自由活動(dòng)時(shí)向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈。評(píng)分為1～3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。

1.5 藥物干預(yù)梓醇低、中、高劑量分別為1、5、10 mg·kg－1，胞磷膽堿給藥劑量為 0.5 g·kg－1。梓醇和胞磷膽堿均用生理鹽水配制，每次給藥總體積為3 ml。生理鹽水組腹腔注射等體積生理鹽水。假手術(shù)組和模型組不給予任何藥物干預(yù)。藥物干預(yù)組均于術(shù)后24 h首次經(jīng)腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)7 d。

1.6 PIC區(qū)GAP-43和P38共定位信號(hào)檢測(cè)與分析

1.6.1 標(biāo)本采集與切片制備 術(shù)后d 15，每組取3只大鼠，深麻醉后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛灌流固定，參照大鼠腦立體定向圖譜，采集視交叉前后2 mm范圍的腦組織塊(含感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū))，速凍后制備30 μm厚的連續(xù)冠狀位腦片，每隔5張取1張，每只大鼠共取10張腦片用于免疫熒光雙標(biāo)組織化學(xué)染色。

1.6.2 免疫熒光雙標(biāo)組織化學(xué)染色步驟 采用自由漂浮法免疫熒光組織化學(xué)染色，用FITC顯示P38陽性表達(dá)，Cy3顯示 GAP-43陽性表達(dá)。腦片用0.02 mol·L－1PBS漂洗3次，正常山羊血清工作液室溫封閉30 min;轉(zhuǎn)入GAP-43和P38混合一抗工作液(GAP-43和P38一抗工作濃度分別為1∶400和1∶200)，4℃孵育過夜(14～16 h)，陰性對(duì)照用0.02 mol·L－1PBS 代替一抗工作液;0.02 mol·L－1PBS漂洗腦片3次，轉(zhuǎn)入Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG(稀釋比例為1∶200)和FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG(稀釋比例為1∶100)混合工作液中，37℃避光孵育1 h;0.02 mol·L－1PBS漂洗腦片4次，裱片，緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.6.3 PIC區(qū)GAP-43和P38共定位信號(hào)分析 腦片置于TCS SP2型激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，每只動(dòng)物觀察3張完整的腦片，相同光學(xué)條件下每張腦片隨機(jī)拍攝PIC區(qū)(距病灶邊緣1～3 mm腦區(qū))3個(gè)互不重疊的視野，分別測(cè)量紅色熒光強(qiáng)度系數(shù)(表征GAP-43表達(dá)強(qiáng)弱)和綠色熒光強(qiáng)度系數(shù)(表征P38表達(dá)強(qiáng)弱)，并用系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行圖像疊加處理，獲得GAP-43和P38共定位信號(hào)圖像(共定位信號(hào)呈黃色)，采用NIH ImageJ圖像分析軟件，分析每組圖像的Pearson相關(guān)系數(shù)，以間接反映共定位像素值的大小。取各指標(biāo)27個(gè)視野的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 電鏡標(biāo)本制備及PIC區(qū)突觸定量分析

1.7.1 電鏡標(biāo)本制備 術(shù)后d 15，將假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組、梓醇中劑量治療組和胞磷膽堿治療對(duì)照組余下的3只大鼠深麻醉后灌流固定，首先灌流生理鹽水100 ml，然后用含4%多聚甲醛、2%戊二醛的0.1 mol·L－1磷酸鹽緩沖液(PBS)灌流固定30 min?？焖贁囝^取腦，取視交叉前后2 mm的腦組織塊(含大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū))，冰臺(tái)上分離缺血灶周邊1～3 mm范圍的幸存感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)，制備1 mm×1 mm×1 mm大腦皮質(zhì)塊，放入4%戊二醛(用0.1 mol·L－1PBS配制)溶液中固定3～4 h;再用0.1 mol·L－1PBS溶液清洗組織塊3次，每次15 min，繼之 1%鋨酸后固定 1 h(4℃)，0.1 mol·L－1PBS溶液清洗組織塊3次，每次15 min。常規(guī)脫水透明，618型環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片定位后，采用Leica-EM UC7型超薄切片機(jī)制備厚度60 nm的超薄切片，切片裱于300目銅網(wǎng)上，后經(jīng)醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，H7500型透射電子顯微鏡下觀察。

1.7.2 圖像采集與體視學(xué)定量分析 電腦采集圖像，自左上往右下順序采集圖片12張，放大倍數(shù)均4萬，每組測(cè)定36張電鏡照片。參照文獻(xiàn)［5］，采用突觸體視學(xué)銅網(wǎng)格法計(jì)算突觸Nv和Sv。電鏡下突觸的辨認(rèn)標(biāo)準(zhǔn):①可見突觸前后膜;② 可見突觸間隙;③可見突觸后致密帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理每組數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 11.5版本進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較用SNK法。

2 結(jié)果

2.1 梓醇促進(jìn)PIC區(qū)有效軸突芽生熒光顯微鏡下見，綠色熒光顯示P38標(biāo)記的突觸前末端，紅色熒光顯示GAP-43表達(dá)陽性的芽生軸突，GAP-43和P38共定位信號(hào)呈現(xiàn)黃色，顯示新生軸突形成突觸的部位。PIC區(qū)幸存大腦皮質(zhì)神經(jīng)氈內(nèi)，可見點(diǎn)狀和顆粒狀密集分布的突觸素P38陽性著色部位(呈現(xiàn)綠色熒光)，部分陽性顆粒圍繞在神經(jīng)元周圍，襯托出神經(jīng)元胞體的輪廓;GAP-43在神經(jīng)元及神經(jīng)突起上表達(dá)較強(qiáng)，陽性著色部位呈點(diǎn)狀、索條狀，部分位于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi);黃色的GAP-43/P38共定位顆粒散在分布于神經(jīng)氈內(nèi)，部分顆粒在神經(jīng)元周圍密集分布，顯示出神經(jīng)元胞體和突起的外形特征。陰性對(duì)照腦片未見陽性熒光信號(hào)。見Fig 1。

Fig 1 Representative images showing co-localisation(yellow)of P38(green)with GAP-43(red)in PIC region in each group

GAP-43和P38共定位分析，紅色熒光強(qiáng)度系數(shù)間接反映GAP-43陽性表達(dá)信號(hào)強(qiáng)弱，系數(shù)越大GAP-43陽性表達(dá)水平越高。紅色熒光強(qiáng)度系數(shù)模型組和生理鹽水組均高于假手術(shù)組，但差異無顯著性(P＞0.05)，梓醇各劑量組均明顯高于模型組(P＜0.05)，且梓醇中劑量組明顯高于胞磷膽堿組(P＜0.05);提示梓醇可促進(jìn)腦缺血后軸突芽生。綠色熒光強(qiáng)度系數(shù)間接反映P38表達(dá)量，系數(shù)越大，P38表達(dá)水平越高。各組間比較，梓醇各劑量組綠色熒光強(qiáng)度系數(shù)均比模型組和胞磷膽堿組明顯增加(P＜0.05)，提示梓醇可增強(qiáng)腦缺血后突觸重構(gòu)。GAP-43和P38之間Pearson相關(guān)系數(shù)反映芽生軸突形成突觸連接的頻度。Pearson相關(guān)系數(shù)越大表明芽生軸突形成突觸連接越多。模型組和生理鹽水組Pearson相關(guān)系數(shù)明顯大于假手術(shù)組(P＜0.05)，提示腦缺血后存在自發(fā)性軸突芽生及突觸新生;梓醇各劑量組均比模型組明顯增大(P＜0.05)，且梓醇中、高劑量組明顯大于胞磷膽堿組，差異具有顯著性(P＜0.05)，提示梓醇可促進(jìn)芽生軸突形成新的突觸連接。見Tab 1。

Tab 1 Comparison of parameters of co-localisation of P38/GAP-43 within PIC region in each group(±s，n=3)

Tab 1 Comparison of parameters of co-localisation of P38/GAP-43 within PIC region in each group(±s，n=3)

*P ＜0.05 vs sham operation group，▲P ＜0.05 vs model group，★P ＜0.05 vs citicoline treatment group.

Group co-localisation of P38/GAP-43/Pearson's correlation coefficient Sham operation 1.04±0.11 0.60 ±0.02 0.14±0.02 P38 expression/green fluorescence intensity GAP-43 expression/red fluorescence intensity Model 1.19±0.10* 0.66 ±0.09 0.27±0.04*Saline 1.14±0.18* 0.68 ±0.03 0.32±0.03*Citicoline 1.01±0.09 0.85 ±0.07＊▲ 0.48±0.01＊▲Low dose of catalpol 1.31±0.03＊▲★ 0.83±0.03＊▲ 0.50±0.04＊▲Middle dose of catalpol 1.38±0.10＊▲★ 0.92±0.06＊▲★ 0.63±0.03＊▲★High dose of catalpol 1.53±0.19＊▲★ 0.80±0.10＊▲ 0.72±0.06＊▲★

2.2 梓醇增加PIC區(qū)突觸數(shù)密度和面密度體視學(xué)定量分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組和生理鹽水組PIC區(qū)神經(jīng)氈內(nèi)突觸Nv和Sv均明顯降低(P＜0.05)，提示腦缺血損傷后存在突觸丟失現(xiàn)象;中劑量梓醇組Nv和Sv均比模型組和生理鹽水組明顯增加(P＜0.05)，但與胞磷膽堿組差異無顯著性(P＞0.05)，接近假手術(shù)組水平(P＞0.05)，提示梓醇可明顯促進(jìn)腦缺血后突觸重構(gòu)。見Fig 2和Tab 2。

3 討論

缺血性腦卒中所致神經(jīng)缺失功能的恢復(fù)依賴于缺血周圍區(qū)幸存腦組織及病灶對(duì)側(cè)功能相似腦區(qū)激活、結(jié)構(gòu)重塑和功能重建。卒中后最初幾周內(nèi)，腦區(qū)激活較為泛化，涉及病灶同側(cè)及對(duì)側(cè)的多個(gè)腦區(qū);隨著神經(jīng)缺失功能恢復(fù)及病程延長(zhǎng)，泛化的腦區(qū)活化模式逐步被PIC區(qū)活化這一局限的類似生理狀態(tài)的活化模式所取代［6］。因此，PIC區(qū)的神經(jīng)可塑性事件一直是卒中后神經(jīng)修復(fù)研究的焦點(diǎn)。

神經(jīng)元軸突芽生及突觸新生是PIC區(qū)代表性神經(jīng)可塑性事件，其發(fā)生發(fā)展具備一定的時(shí)空特點(diǎn)。時(shí)間上，軸突芽生存在4個(gè)關(guān)鍵時(shí)段［7］:卒中后最初3 d內(nèi)為軸突芽生觸發(fā)階段;3～7 d為起始階段，伴隨大量生長(zhǎng)促進(jìn)因子表達(dá)上調(diào);7～14 d進(jìn)入維持階段，大部分軸突生長(zhǎng)，促進(jìn)蛋白呈峰值表達(dá)并維持在平臺(tái)水平，如GAP-43、CAP23及c-jun等;14～28 d進(jìn)入軸突芽生終末階段，此時(shí)新的軸突投射模式基本構(gòu)建完畢?？臻g上，大鼠感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)小灶梗死后，梗死灶周邊2 mm范圍的幸存腦組織軸突芽生最明顯［7－8］。可見，卒中后2周是對(duì)軸突芽生和突觸新生進(jìn)行過程性評(píng)價(jià)的關(guān)鍵時(shí)點(diǎn)，梗死灶周邊1～3 mm的環(huán)形腦區(qū)是研究卒中后軸突芽生/再生和突觸新生的重要區(qū)域。

Fig 2 Representative electron micrographs used to evaluate synapse(arrow)density within peri-infarct cortex

Tab 2 Comparison of synaptic number density and surface density within PIC region in each group(±s，n=3)

Tab 2 Comparison of synaptic number density and surface density within PIC region in each group(±s，n=3)

▲P ＜0.05 vs sham operation group;△P ＜0.05 vs model group.

Group Number density/Nv，number/μm3 Surface density/Sv，μm2/μm3 Sham operation 0.85 ±0.36 0.066 ±0.025 Model 0.54 ±0.28▲ 0.036 ±0.032▲Normal saline 0.58 ±0.37▲ 0.041 ±0.034▲Citicoline 0.76 ±0.36△ 0.059 ±0.02△Middle dose of catalpol 0.78 ±0.42△ 0.062 ±0.03△

神經(jīng)元軸突芽生/再生和突觸新生需要合成新的蛋白以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)錐的形成、維持和延伸，并使軸突芽生與突觸新生同步化。其中，GAP-43是一種分子量為43 ku的神經(jīng)特異性蛋白，富集于軸突生長(zhǎng)錐質(zhì)膜，參與軸突生長(zhǎng)錐形成，引導(dǎo)軸突生長(zhǎng)和延伸，調(diào)節(jié)軸突芽生與新突觸形成同步化，是國(guó)際公認(rèn)的軸突再生分子標(biāo)志。突觸素P38是突觸前囊泡特有的鈣結(jié)合糖蛋白，與神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸囊泡再循環(huán)和突觸新生等都有密切關(guān)系，是突觸前終末的特異性分子標(biāo)記物，也是突觸傳遞效能的反映。在腦損傷后軸突生長(zhǎng)維持階段，P38與GAP-43的比值可反映突觸新生能力，但芽生軸突建立突觸連接后，GAP-43的表達(dá)下調(diào)，趨于基線水平［9］。腦缺血損傷后，由于能量代謝障礙，蛋白表達(dá)譜調(diào)節(jié)異常以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突生長(zhǎng)限制性微環(huán)境等諸多因素影響，相當(dāng)一部分芽生軸突不能形成功能性突觸連接，即無效軸突芽生。成熟期線蟲的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突切斷后，大約70%的受損軸突末端形成了生長(zhǎng)錐，但僅有不到10%的芽生/再生軸突與靶組織建立了連接［10］。因此，促進(jìn)芽生軸突形成新的突觸連接(即有效軸突芽生)成為重要的神經(jīng)修復(fù)策略。

課題組前期研究觀察到［3－4］，梓醇可上調(diào)局灶腦缺血大鼠梗死灶周圍區(qū)大腦皮質(zhì)GAP-43表達(dá)，增加腦梗死灶周圍區(qū)大腦皮質(zhì)神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目，但梓醇能否誘導(dǎo)新生軸突形成突觸尚未進(jìn)行探討。因此，本研究采用免疫熒光雙標(biāo)組織化學(xué)染色技術(shù)，用GAP-43標(biāo)記芽生軸突，P38標(biāo)記突觸，GAP-43和P38共定位顯示芽生軸突形成的新的突觸終末，觀察梓醇對(duì)新生軸突形成突觸的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦缺血后15 d，PIC區(qū)神經(jīng)氈內(nèi)可見大量GAP-43和P38共定位信號(hào)，呈黃色，密集分布在神經(jīng)元周圍，顯示出神經(jīng)元胞體和突起的外形特征。量化分析各組GAP-43和P38共定位信號(hào)，結(jié)果梓醇治療組Pearson相關(guān)系數(shù)明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，表明梓醇組有更多的芽生軸突形成了突觸前末端，提示梓醇可促進(jìn)芽生軸突形成新的突觸連接。

既往研究證實(shí)，胞磷膽堿是磷脂生物合成過程中的一種關(guān)鍵物質(zhì)，參與卒中后神經(jīng)生成、軸突芽生/再生以及突觸生成過程。外源性給予胞磷膽堿可加快磷脂合成和神經(jīng)修復(fù)，目前廣泛用于卒中后神經(jīng)修復(fù)治療［11］。近期研究發(fā)現(xiàn)，胞磷膽堿可促進(jìn)卒中后神經(jīng)再生［12］，誘導(dǎo)樹突芽生［13］，上調(diào)突觸素表達(dá)［14］，與梓醇具有相似的神經(jīng)藥理作用機(jī)制，故課題組將其作為陽性藥物對(duì)照。本研究結(jié)果顯示，梓醇較胞磷膽堿更能誘導(dǎo)新生軸突形成新的突觸，提示梓醇作為神經(jīng)修復(fù)治療藥物極具臨床轉(zhuǎn)化潛能。

腦缺血后受累神經(jīng)元突觸數(shù)量減少，效能降低，神經(jīng)環(huán)路信息傳遞障礙是腦缺血后出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙的重要因素。新突觸形成、突觸數(shù)密度增加、突觸面密度增大以及突觸傳遞效能增強(qiáng)是突觸重構(gòu)的主要體現(xiàn)。突觸數(shù)密度是指一定參照空間內(nèi)突觸的數(shù)目，直接反映神經(jīng)活動(dòng)過程中神經(jīng)元接點(diǎn)數(shù)目的多少;突觸面密度是指一定參照空間內(nèi)突觸的總面積，直接反映神經(jīng)活動(dòng)中神經(jīng)元接點(diǎn)面積的大小。本研究在證實(shí)梓醇可促進(jìn)芽生軸突形成新的突觸終末的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用透射電鏡結(jié)合體視學(xué)方法定量檢測(cè)PIC區(qū)突觸數(shù)密度和面密度，評(píng)價(jià)梓醇對(duì)突觸重構(gòu)的終末效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中劑量梓醇治療組PIC區(qū)突觸的數(shù)密度和面密度均比模型組和生理鹽水組明顯增加，接近假手術(shù)組水平，提示梓醇可誘導(dǎo)突觸重構(gòu)，增加突觸連接點(diǎn)數(shù)目及突觸連接面。這有助于神經(jīng)環(huán)路修復(fù)過程中功能性神經(jīng)連接的重建。

綜上，本研究結(jié)果表明，梓醇可促進(jìn)缺血性腦卒中大鼠PIC區(qū)芽生軸突形成新的突觸連接，增強(qiáng)突觸新生能力，誘導(dǎo)突觸重構(gòu)，為合理闡釋梓醇促卒中后神經(jīng)修復(fù)作用及機(jī)制提供了較為直觀的形態(tài)學(xué)依據(jù)，并為卒中后促神經(jīng)修復(fù)藥物研發(fā)提供了理想的候選。

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