徐錦程，夏 飛，張 配，浦龍健，黃瑩瑩，李 陽，張媛媛，劉 浩

(蚌埠醫(yī)學(xué)院1.第一附屬醫(yī)院，安徽蚌埠 233004;2.藥學(xué)系，安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠 233030)

口腔鱗癌(oral squamous carcinoma，OSCC)是常見的惡性腫瘤，占全身腫瘤的3%。每年全球有50萬新發(fā)病例，患者的5年生存率僅50%［1］?；熓强谇话┲匾妮o助治療方法之一，但是當(dāng)前化療面臨的主要問題是癌細胞對化療藥物的敏感性下降，導(dǎo)致多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的產(chǎn)生，使癌細胞產(chǎn)生具有同時抵抗結(jié)構(gòu)及功能作用各不相同的廣譜化療藥物的能力［2］。因此，研究其耐藥機制、克服化療耐藥，發(fā)現(xiàn)新的靶點是腫瘤研究的熱點之一［3］。本文研究了糖基化抑制劑TM對人口腔癌KB細胞增殖及凋亡的影響，并聯(lián)合常用治療口腔癌藥物奧沙利鉑，檢測TM增強奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔癌細胞的凋亡作用，并對其初步機制進行探討，為口腔癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人口腔上皮癌細胞株KB細胞由中科院上海細胞庫購得。

1.1.2 主要試劑 Minimum Essential Medium(MEM)培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素:美國Invitrogen公司。胎牛血清:杭州四季青公司。奧沙利鉑:批號:H20093167，齊魯制藥有限公司產(chǎn)品。噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT):Sigma進口分裝。Caspase-3活性檢測試劑盒:碧云天公司。兔抗人Glucose regulated protein 78抗體，鼠抗人 β-actin:Santa Cruz公司。兔抗人Caspase-3抗體:Abcam公司。兔抗人 Caspase-12抗體:碧云天公司。WBKLS0500底物顯色試劑為Millipore產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 口腔上皮癌細胞KB采用MEM培養(yǎng)液，含10%滅活胎牛血清，2.0 g·L－1Hepes，2.0 g·L－1碳酸氫鈉，1 × 105IU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測細胞存活率 單層培養(yǎng)的KB細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后配成單細胞懸液，接種于96孔板，密度 7 ×104個/孔，每孔 100 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，加入含10%胎牛血清新鮮培養(yǎng)液，實驗設(shè)調(diào)零組，每組設(shè)3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。結(jié)束培養(yǎng)4 h前，每孔加入15 μl MTT(5 mg·L－1溶液，孵育，終止培養(yǎng)后加入三聯(lián)液100 μl過夜，振蕩，酶標(biāo)儀檢測570 nm波長吸光度值A(chǔ)，按公式，存活率/%=(藥物組A值－調(diào)零組A值)/(對照組A－調(diào)零組A值)×100%，計算癌細胞存活率。

1.2.3 集落克隆形成實驗 接種細胞于6孔細胞培養(yǎng)板，密度1×104個/孔，24 h后吸棄培養(yǎng)液，分別加 0.25 μmol·L－1衣霉素、0.125 μmol·L－1奧沙利鉑以及兩者合用處理細胞，每孔加入含10%血清新鮮MEM培養(yǎng)液2 ml，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，5 d后終止培養(yǎng)，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌1遍，體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛 －20℃固定10 min，棄固定液，加結(jié)晶紫染色液室溫染色10 min，去離子水緩慢洗去染色液，室溫下干燥，拍照。

1.2.4 PI染色檢測凋亡 將人口腔癌KB細胞接種于6孔培養(yǎng)板，密度1×105個/孔，分別加入衣霉素、奧沙利鉑以及二者合用，同時設(shè)對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后獲取細胞，PBS洗滌2遍，加入體積分?jǐn)?shù)為0.70的冷乙醇固定，4℃過夜，PBS洗去固定液，PI染液混勻后，避光2 h，用流式細胞儀作流式細胞分析，檢測具有亞G1期DNA含量的細胞比例，代表凋亡細胞數(shù)。

1.2.5 Caspase-3活性檢測 接種細胞于6孔細胞培養(yǎng)板，密度1×106個/孔，分別加入衣霉素、奧沙利鉑以及二者合用，同時設(shè)對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后獲取細胞。將細胞重新懸浮于50 μl冷細胞裂解緩沖液中，冰上放置10 min。4℃下12 000 r·min－110 min以去除細胞碎片。將上清轉(zhuǎn)移至另一微離心管中，置于冰上。向每組加入50 μl的2×反應(yīng)緩沖液/DTT混合液。向每管加入5 μl的1 mmol·L－1Caspase-3底物。水浴37℃孵育1 h。在405 nm波長下讀取OD值。根據(jù)試劑盒說明所得斜率值，按Caspase-3活性單位=(試驗組OD－對照組OD)/斜率，計算Caspase-3活性單位。

1.2.6 Western blot檢測蛋白 取對數(shù)生長期的人口腔癌KB細胞，按每孔8×105個細胞接種于6孔板上，培養(yǎng)24 h后加入藥物。加藥培養(yǎng)24 h后，收集各組細胞，細胞裂解液裂解細胞后提取細胞總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。用細胞裂解液將各組蛋白稀釋至等濃度，與2×上樣緩沖液1∶1混合，100℃煮沸5 min蛋白變性，每組各取30 μg總蛋白樣品，采用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，電泳分離后的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，5% 脫脂牛奶封閉過夜，一抗(1∶500稀釋)與轉(zhuǎn)移膜反應(yīng)2 h，TBST洗膜5 min×3次。二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次，PBS洗膜1次;Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate試劑盒用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 衣霉素增強奧沙利鉑對人口腔癌KB細胞增殖的抑制作用實驗中用不同濃度的衣霉素、奧沙利鉑以及聯(lián)合使用，能明顯抑制口腔癌細胞KB生長。0.125 μmol·L－1衣霉素作用于人口腔癌 KB細胞 24、48、72 h存活率為 90.37%、89.44%、88.91%;1 μmol·L－1奧沙利鉑作用于人口腔癌 KB細胞24、48、72 h存活率分別為62.36%、47.54%、40.47%。0.125 μmol·L－1衣霉素與 1 μmol·L－1奧沙利鉑誘導(dǎo)人口腔癌KB細胞24、48、72 h的存活率為50.78%、37.77%、23.24%，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見Fig 1。

2.2 衣霉素增強奧沙利鉑對人口腔癌KB細胞集落克隆形成的抑制作用根據(jù)MTT實驗結(jié)果使用低于 IC50的 0.25 μmol·L－1衣霉素、0.125 μmol·L－1奧沙利鉑以及二者聯(lián)合刺激細胞，使用集落克隆形成實驗檢測藥物對人口腔癌KB細胞增殖抑制作用的影響。結(jié)果表明，衣霉素在低濃度即可增強奧沙利鉑對人口腔癌KB細胞的集落克隆形成的抑制(Fig 2)。

Fig 1 Effects of drugs on viability of KB cells

Fig 2 TM increased inhibitory effect of L-OPH on colony formation of KB cells

2.3 衣霉素增強奧沙利鉑誘導(dǎo)人口腔癌KB細胞凋亡的作用不同藥物對口腔癌KB細胞株作用48 h時的凋亡率比較:0.5 μmol·L－1衣霉素刺激 48 h，誘導(dǎo)人口腔癌 KB細胞的凋亡率為8.3%。1 μmol·L－1奧沙利鉑誘導(dǎo)人口腔癌KB細胞48 h的凋亡率為 24.6%。0.5 μmol·L－1衣霉素對 1 μmol·L－1奧沙利鉑誘導(dǎo)人口腔癌KB細胞48 h的凋亡率為50.3%，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，F(xiàn)ig 3)。上述結(jié)果表明，衣霉素可以增強奧沙利鉑誘導(dǎo)的口腔癌細胞凋亡。

2.4 衣霉素增強奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔癌KB細胞的Caspase-3激活作用為觀察衣霉素及其聯(lián)合奧沙利鉑作用下對人口腔癌KB細胞Caspase-3活性的影響，根據(jù)Caspase-3活性試劑盒檢測藥物處理前后Caspase-3活性的變化，實驗結(jié)果表明:衣霉素刺激細胞后，并未出現(xiàn)Caspase-3的激活，但衣霉素對奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔癌KB細胞Caspase-3激活有明顯的增強作用(P＜0.01，F(xiàn)ig 4)。

2.5 衣霉素對奧沙利鉑誘導(dǎo)的人口腔癌KB細胞的GRP-78、Caspase-12和Caspase-3蛋白表達的影響人口腔癌KB細胞給予不同的刺激后收集蛋白，Western blot檢測GRP-78、Caspase-12 和Caspase-3蛋白的表達，從Fig5可以看出，衣霉素可誘導(dǎo)細胞GRP-78的表達，衣霉素聯(lián)合奧沙利鉑處理KB細胞后，可誘導(dǎo)更強烈的GRP-78的表達。同時可以看到特異性定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白Caspase-12的表達，聯(lián)合用藥組高于單獨用藥組，蛋白Caspase-3的表達聯(lián)合用藥組高于單獨用藥組(Fig 5)。

Fig 5 Expressions of GRP78 Caspase-12 and Caspase-3 in KB cells

3 討論

腫瘤細胞的增殖和凋亡失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因，因此抑制腫瘤增殖和促進腫瘤凋亡是藥物治療腫瘤的關(guān)鍵。然而臨床上出現(xiàn)對抗腫瘤藥物耐受現(xiàn)象，常導(dǎo)致化療失敗［2，4－5］。因此尋求低劑量的藥物以及降低藥物對人體的副作用成為我們關(guān)注重點。糖基化抑制劑衣霉素的抗腫瘤作用被廣泛關(guān)注，從培養(yǎng)細胞到實驗動物，以及臨床實驗不斷的開展，并針對單獨抗腫瘤到與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用方面進行探索［6－7］。本次研究觀察了衣霉素增強奧沙利鉑抗口腔癌的作用。從上述的結(jié)果可以看出，衣霉素可增加奧沙利鉑對口腔癌細胞KB的增殖抑制作用，增強其誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡;衣霉素還可增高奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔癌細胞KB的GRP-78表達，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，并增強Caspase-3蛋白的表達。

目前，越來越多的研究提示，細胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下(鈣離子平衡失調(diào)、缺氧、營養(yǎng)缺乏等)激活未折疊蛋白反應(yīng)，通過IRE1、ATF6、PERK起始的3條信號通路，使得多基因轉(zhuǎn)錄激活，翻譯普遍減少而選擇性翻譯特性的蛋白質(zhì)，促進蛋白的正確翻譯和折疊，來適應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，因此未折疊蛋白反應(yīng)被認為是細胞的一種保護機制［8－10］。但是有大量報道提示應(yīng)激過強或持續(xù)時間過長內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂不能恢復(fù)反而可以通過激活COHP/CADD153路徑、Caspase路徑等促進細胞凋亡［11］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的中心調(diào)節(jié)者，由于其在蛋白折疊、聚集、促進非折疊蛋白降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子連接和控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感受器激活等過程中具有重要的作用，因此GRP78的誘導(dǎo)被廣泛用作內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和UPR啟動的生物標(biāo)記［12］。無內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時GRP78分別和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的應(yīng)激感受蛋白IRE1α、ATF6、PERK結(jié)合處于無活性狀態(tài)。但當(dāng)鈣離子平衡失調(diào)、缺氧、營養(yǎng)缺乏時，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)，未折疊蛋白堆積使得GRP78與應(yīng)激感受蛋白分離，因此GRP78高表達是口腔癌細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的化療耐受的原因之一［12－13］。本研究中，口腔癌細胞GRP78表達量很少，然而在衣霉素刺激24 h后GRP78表達量增加。說明衣霉素上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78的表達，啟動UPR反應(yīng)。而當(dāng)用衣霉素和奧沙利鉑聯(lián)合刺激24 h后GRP78表達量增加，這提示我們過強的應(yīng)激有可能超過UPR對細胞保護作用的能力，從而激活了下游Caspase的活性，促進腫瘤細胞的凋亡。

Caspase-12定位于ER膜上，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的關(guān)鍵分子，以前體形式存在當(dāng)沒有發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，Caspase-12的表達量很少，僅在ERS刺激下活化，發(fā)生自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)的移位，表達量增加，激活的Caspase-12可剪切細胞凋亡途徑中公共下游效應(yīng)分子 Caspase-3，并最終導(dǎo)致細胞凋亡［14－15］。本研究中口腔癌細胞中經(jīng)衣霉素、奧沙利鉑以及二者合用刺激24 h后Caspase-12的表達增加，并且剪切Pro-caspase-3，使得 Caspase-3的表達上調(diào)。同時，對于Caspase-3活性的檢測也同樣提示:合用組的Caspase-3活性明顯高于單用組及對照組。這些結(jié)果都說明了過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)促使UPR從細胞保護轉(zhuǎn)變成促進細胞凋亡，而這一凋亡的機制是通過激活一系列Caspase。當(dāng)然，關(guān)于ER應(yīng)激的不同程度對腫瘤細胞存活的影響以及通過何種路徑激發(fā)腫瘤細胞的凋亡尚需要更多的實驗進行說明。這也是本研究需要進一步深入探討的問題，而本次研究恰為深入認識ER應(yīng)激提供一定的實驗基礎(chǔ)。

總之，本研究證實了糖基化抑制劑衣霉素對人口腔癌細胞的增殖具有抑制作用，并且可以明顯增加臨床常用治療口腔癌細胞的藥物誘導(dǎo)口腔癌細胞的凋亡作用。其機制可能是通過誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生過多ER應(yīng)激反應(yīng)，增強Caspase-3活性而發(fā)揮作用。

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