李 靜，王 濤

(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.機能實驗中心、2.病理生理學(xué)教研室，安徽合肥 230032)

目前原發(fā)性肝癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率居各種惡性腫瘤的第6位，致死率居第3位。由于肝癌早期診斷率較低，系統(tǒng)化療仍是進展期肝癌病人的主要臨床治療手段［1-2］。但是肝癌病人對化療藥物的多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)成為臨床治療的一大障礙［3-4］。MDR產(chǎn)生的一大重要機制是腫瘤細胞內(nèi)出現(xiàn)了耐藥基因MDR-1的高表達。MDR-1基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物為P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)，它發(fā)揮的主要功能是將進入腫瘤細胞內(nèi)的化療藥物泵出細胞外，降低藥物的作用效率，并可以抑制 caspase的活性，減少腫瘤細胞的凋亡率［3-4］。目前許多研究組致力于P-gp抑制劑的研究工作［5-6］。然而這些研究并不能解決肝癌臨床治療的根本問題，因為許多促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因，如NF-κB、ERK和HIF-1等，一方面促進肝癌細胞的增殖或抑制其凋亡，另一方面可以上調(diào)P-gp的表達促進肝癌的多藥耐藥性［7-9］。因此單一用藥無法完全逆轉(zhuǎn)肝癌的MDR，尋找新的藥物作用靶點成為目前研究的熱點。

ZNF300基因是一種與人胚胎發(fā)育相關(guān)的KRAB類鋅指蛋白基因［10］，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)ZNF300基因在肝癌和其他腫瘤，如結(jié)腸癌和肺癌等多種腫瘤組織中高表達，而在癌旁組織中無明顯表達;進一步研究發(fā)現(xiàn)，ZNF300基因的過表達可以通過上調(diào)NF-κB的活性，促進ERK的磷酸化，抑制p21、p27的表達，促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移;通過反義cDNA的轉(zhuǎn)染抑制ZNF300的表達則出現(xiàn)相反的效果［11-12］。由于NF-κB和ERK都可以通過上調(diào) P-gp的高表達促進肝癌的 MDR，為觀察ZNF300基因能否作為逆轉(zhuǎn)肝癌多藥耐藥的候選藥物作用靶點，在本項目中，我們擬通過體外低濃度梯度遞增法構(gòu)建 HepG2/VCR耐藥細胞株，檢測HepG2/VCR與普通HepG2細胞中的ZNF300基因與P-gp的表達差異，分析ZNF300基因與肝癌MDR的相關(guān)性;并在HepG2/VCR細胞中轉(zhuǎn)染ZNF300正向或反義cDNA質(zhì)粒，觀察ZNF300表達上調(diào)或下調(diào)后，HepG2/VCR細胞中 P-gp的表達變化，及HepG2/VCR細胞IC50值的變化，初步分析ZNF300基因在肝癌MDR中的相關(guān)功能。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體人肝癌細胞株HepG2購自中科院上海細胞庫;DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清(fatal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司;長春新堿(vincristine，VCR)購自合肥華澤生物有限公司;四甲基偶氮唑鹽〔3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3， 5-di-phenytetrazo liumromide，MTT〕購自Sigma公司;小鼠抗人P-gp單克隆抗體購自Cell Signaling公司;小鼠抗人GAPDH抗體購自上海康成公司;兔抗人ZNF300多克隆抗體為武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李文鑫教授饋贈;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠第二抗體購自合肥華澤生物有限公司;ECL顯影試劑盒購自Pierce公司;預(yù)染蛋白分子量Marker購自Fermentas公司;PVDF膜購自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及 HepG2/VCR的構(gòu)建 HepG2細胞轉(zhuǎn)于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周傳代2-3次，取對數(shù)生長期的細胞用于試驗。肝癌多藥耐藥細胞株HepG2/VCR的建立采用長春新堿(VCR)低濃度梯度遞增誘導(dǎo)法［13］，直至HepG2/VCR細胞能在含VCR 1 mg·L-1的培養(yǎng)液中維持生長，并利用MTT法檢測其耐藥性。

1.2.2 HepG2/VCR耐藥性的鑒定 為鑒定HepG2/VCR的耐藥性，將 HepG2/VCR和普通HepG2細胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期后，按5×103個細胞/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度VCR(0.01、0.1、1、10 和100 mg·L-1)處理24 h，進行MTT檢測，繪制生長曲線。

1.2.3 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 正向和反向ZNF300基因cDNA克隆入IRES-GFP真核表達質(zhì)粒中，分別命名為 IRES-ZNF300-GFP和 IRES-ASZNF300-GFP，克隆方法見參考文獻［12］。用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將IRES-ZNF300-GFP和IRES-ASZNF300-GFP及其對照質(zhì)粒IRES-GFP轉(zhuǎn)染入HepG2/VCR細胞中，轉(zhuǎn)染方法為:將HepG2/VCR細胞按5×105個細胞/孔接種于6孔板，在含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至轉(zhuǎn)染前細胞密度達到80% ～90%;按轉(zhuǎn)染試劑說明書配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物(Lipofectamine 2000):在250 μl Opti-MEM 中加入10 μl轉(zhuǎn)染試劑;質(zhì)粒復(fù)合物:在250 μl Opti-MEM中加入4 μg質(zhì)粒;室溫靜置5 min后將質(zhì)粒復(fù)合物加入轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物中，使之形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，室溫靜置20 min，每孔細胞中加入1.5 ml無血清無雙抗DMEM培養(yǎng)液，將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物輕輕混勻加入細胞中，在含5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后;將每孔細胞更換成2 ml有血清的DMEM培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.4 Western blot檢測 Western blot方法用于檢測HepG2/VCR和普通HepG2細胞中ZNF300和P-gp蛋白質(zhì)的表達差異，及HepG2/VCR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后ZNF300和P-gp蛋白質(zhì)的表達變化。收取經(jīng)上述細胞，用含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、氟化鈉和釩酸鈉的加樣緩沖液冰上靜置裂解細胞10 min，再100℃變性10 min即為全細胞裂解液，SDS-PAGE凝膠電泳后冰浴濕式轉(zhuǎn)印至PVDF膜，參數(shù)為恒壓80V ×3 h.用含 0.5 g·L-1脫脂奶粉和 0.5 ml吐溫20的PBST封閉30 min后，按抗體廠家建議稀釋一抗后4℃敷膜結(jié)合過夜，待檢測抗體為ZNF300多克隆抗體和P-gp單克隆抗體，以GAPDH抗體為內(nèi)參。一抗結(jié)合后PBS-T洗膜10 min×3次，加入適當(dāng)稀釋度的二抗，室溫?fù)e床結(jié)合2 h，再次PBS-T洗膜10 min×3次，暗室內(nèi)ECL顯色，柯達膠片感光顯影并掃描。

1.2.5 MTT檢測及IC50值計算 HepG2/VCR細胞按5×103個細胞/孔接種于6孔板，進行ZNF300相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h，用0.25%胰酶消化重懸，按5×103個細胞/孔接種于96孔板，24 h后加入不同濃度VCR(0.125、0.25、0.5、1和2mg·L-1)干預(yù) 24 h，在終止培養(yǎng)前4 h加MTT溶液(0.5 mg·L-1)。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，置于搖床上15 min，使結(jié)晶物充分溶解;置酶標(biāo)儀上檢測各孔吸光度值(A570nm)，實驗至少重復(fù)3次。根據(jù)MTT結(jié)果繪制生長曲線，并采用中效分析軟件(Logit法)計算質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，HepG2/VCR細胞對VCR的半數(shù)抑制濃度值(50%inhibitory concent ration，IC50)變化，按以下公式計算耐藥指數(shù)(resistance index，RI)。RI=IC50質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞/IC50親本細胞。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以±s表示，組間數(shù)據(jù)的顯著性檢驗采用ANOVA法分析。

2 結(jié)果

2.1 肝癌耐藥細胞株HepG2/VCR耐藥性的鑒定篩選出的HepG2/VCR細胞和HepG2細胞在其指數(shù)生長期時，分別加入不同濃度 VCR(0.01、0.1、1、10和100 mg·L-1)處理24 h，經(jīng)MTT檢測后繪制生長曲線后發(fā)現(xiàn)，HepG2/VCR細胞對VCR的耐藥性相對于 HepG2細胞明顯增高(P＜0.05，ANVOA)(Fig 1)，說明肝癌耐藥細胞株HepG2/VCR構(gòu)建成功。

Fig 1 MTT analysis of HepG2/VCR and HepG2 treated with different concentrations of VCR

2.2 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)HepG2/VCR細胞中ZNF300和P-gp表達增高HepG2/VCR細胞和HepG2細胞在其指數(shù)生長期時收取蛋白質(zhì)，進行Western blot檢測，樣品各點兩道，用兔抗人ZNF300多克隆抗體和鼠抗人P-gp單克隆抗體進行檢測，以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果如Fig 2所示，可見在GAPDH表達基本一致的情況下，HepG2/VCR細胞中ZNF300和P-gp的表達明顯高于HepG2細胞，提示ZNF300基因與HepG2/VCR細胞的耐藥性和P-gp的表達有相關(guān)性。

2.3 ZNF300基因表達變化對HepG2/VCR細胞中P-gp表達及耐藥性的影響在HepG2/VCR細胞中轉(zhuǎn)染，將IRES-ZNF300-GFP和IRES-ASZNF300-GFP及其對照質(zhì)粒IRES-GFP，轉(zhuǎn)染后48 h，收取蛋白質(zhì)，用兔抗人ZNF300多克隆抗體和鼠抗人P-gp單克隆抗體進行Western blot檢測，以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果如Fig 3所示，可見在GAPDH表達基本一致的情況下，IRES-ZNF300-GFP組細胞中ZNF300和P-gp表達明顯高于空載體組和親本細胞組，IRES-ASZNF300-GFP組細胞中結(jié)果相反，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后可有效促進ZNF300在細胞中的高表達或Knockdown，ZNF300高表達可上調(diào) P-gp的表達，ZNF300基因knockdown則可抑制P-gp的表達。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，加入不同濃度 VCR(0.125、0.25、0.5、1和2 mg·L-1)干預(yù)24 h行MTT檢測繪制生長曲線(Fig 4)，并計算 IC50值和 RI值變化(Tab 1)，可見ZNF300基因高表達可促進HepG2/VCR的耐藥性，而ZNF300基因Knockdown則有相反的結(jié)果(P＜0.05)。說明ZNF300基因可以通過上調(diào)P-gp的表達促進HepG2/VCR的耐藥性。

Tab 1 Drug resistance of HepG2/VCR improved by ZNF300 overexpression

Fig 4 Drug resistance of HepG2/VCR cells promoted by ZNF300 overexpression

3 討論

對于原發(fā)性肝癌，有效的臨床治療手段在于早期診斷和手術(shù)切除原發(fā)病灶，但是目前臨床上確診的大多數(shù)肝癌病人已處于進展期，所以系統(tǒng)化療仍是目前肝癌臨床治療的主要手段［1-2］。然而肝癌病人對傳統(tǒng)化療藥物均會出現(xiàn)多藥耐藥(MDR)現(xiàn)象，所以肝癌病人的預(yù)后往往極為不好［3-4］。近年來隨著分子靶向藥物的研究進展，以Sorafenib為代表的一些藥物被批準(zhǔn)上市，給肝癌的臨床治療帶來新的希望，然而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)病人同樣會對Sorafenib產(chǎn)生耐藥性［3］。所以對于肝癌MDR逆轉(zhuǎn)藥物或藥物作用靶點的研究成為目前的研究熱點。

現(xiàn)在認(rèn)為肝癌MDR產(chǎn)生的一個最主要的機制在于 MDR-1基因產(chǎn)物 P-糖蛋白(P-gp)的高表達［4］。P-gp是一個170 ku大小的蛋白質(zhì)成分，表達于腫瘤細胞的細胞膜，屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter)家族成員，主要功能在于將進入細胞的藥物泵出細胞外以達到減少藥物對細胞毒性的目的［4］。在本項目中，我們采用長春新堿(VCR)低濃度梯度遞增誘導(dǎo)法建立HepG2/VCR耐藥細胞株，通過MTT檢測確定其構(gòu)建成功，經(jīng)Western blot檢測后發(fā)現(xiàn)，HepG2/VCR細胞中的P-gp表達水平明顯高于HepG2細胞，這與前期研究報道相符［13］。

然而目前許多抑制P-gp表達的藥物并不能根本解決肝癌MDR的實際問題，因為肝癌MDR的產(chǎn)生是一個多因素參與的過程，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)許多促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因，如NF-κB和ERK，一方面可以抑制腫瘤細胞凋亡，另一方面亦可上調(diào)P-gp的表達，在肝癌 MDR的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要的作用［4，7-8］。所以尋找新的藥物作用靶點與P-gp抑制劑共同作用來逆轉(zhuǎn)MDR成為一種新的策略。

ZNF300基因最初是從人胚胎cDNA文庫中篩選出來的一種KRAB類鋅指蛋白基因，前期研究發(fā)現(xiàn)其KRAB區(qū)可以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，其鋅指區(qū)可以結(jié)合CG富含的啟動子區(qū)域［10-12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ZNF300基因可以通過調(diào)控TRAF2基因的表達，同時結(jié)合IKKβ蛋白質(zhì)來促進NF-κB通路的活性，進一步研究發(fā)現(xiàn)ZNF300高表達可以促進ERK的磷酸化，從而促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而NF-κB和ERK都可上調(diào) P-gp的表達［12］。利用免疫組織化學(xué)檢測我們發(fā)現(xiàn)ZNF300基因在肝癌等多種腫瘤組織細胞中高表達，而在癌旁組織中表達較低［12］。綜合上述研究基礎(chǔ)，在本項目中，我們利用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)HepG2/VCR細胞中ZNF300的表達明顯高于HepG2細胞，并與P-gp的表達有相關(guān)性，提示ZNF300基因可能參與肝癌MDR的形成過程。在進一步的實驗中，我們將正向和反向ZNF300基因cDNA轉(zhuǎn)染入HepG2/VCR細胞中，經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn)正向cDNA的轉(zhuǎn)染可以明顯促進ZNF300的表達，并上調(diào)P-gp在HepG2/VCR中的表達，MTT檢測發(fā)現(xiàn)ZNF300基因高表達可以促進HepG2/VCR的耐藥性。而反向ZNF300基因cDNA則有完全相反的結(jié)果。

上述實驗結(jié)果說明ZNF300基因在肝癌耐藥細胞株中高表達，并可以通過上調(diào)耐藥基因P-gp的表達促進肝癌的多藥耐藥性，初步證明ZNF300可以作為逆轉(zhuǎn)肝癌MDR的潛在藥物作用靶點。而ZNF300基因在肝癌MDR發(fā)生發(fā)展過程中的發(fā)揮作用的具體機制尚待進一步研究。

［1］ El-Serag H B.Hepatocellular carcinoma［J］.N Engl J Med，2011，365(12):1118-27.

［2］ Livraghi T，M?kisalo H，Line P D.Treatment options in hepatocellular carcinoma today［J］.Scand J Surg，2011，100(1):22-9.

［3］ Gauthier A，Ho M.Role of sorafenib in the treatment of advanced hepatocellular carcinoma:An update［J］.Hepatol Res，2013，43(2):147-54.

［4］ D＇Alessandro N，Poma P，Montalto G.Multifactorial nature of hepatocellular carcinoma drug resistance:could plant polyphenols be helpful［J］?World J Gastroenterol，2007，13(14):2037-43.

［5］ 戴春嶺，符立梧.腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究進展［J］.中國藥理學(xué)通報，2005，21(5):513-8.

［5］ Dai C L，F(xiàn)u L W.The development of the reversal of the tumor multidrug resistance［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(5):513-8.

［6］ 石俊敏，張冬梅，姚 楠，等.三萜皂苷Saxifragifolin D抑制人肝癌耐藥細胞HepG2/ADM生長并誘導(dǎo)細胞凋亡作用研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，28(1):34-8.

［6］ Shi J M，Zhang D M，Yao N，et al.Studies of the cell proliferative inhibition and apoptosis induced by Saxifragifolin D on HepG2/ADM cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(1):34-8.

［7］ Liu Y，Lou G，Wu W，et al.Involvement of the NF-κB pathway in multidrug resistance induced by HBx in a hepatoma cell line［J］.J Viral Hepat，2011，18(10):e439-46.

［8］ Yan F，Wang X M，Pan C，et al.Down-regulation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 activity in P-glycoprotein-mediated multidrug resistant hepatocellular carcinoma cells［J］.World J Gastroenterol，2009，15(12):1443-51.

［9］ Comerford K M，Wallace T J，Karhausen J，et al.Hypoxia-inducible factor-1-dependent regulation of the multidrug resistance(MDR1)gene［J］.Cancer Res，2002，62(12):3387-94.

［10］ Gou D，Wang J，Gao L，et al.Identification and functional analysis of a novel human KRAB/C2H2 zinc finger gene ZNF300 ［J］.Biochim Biophys Acta，2004，1676(2):203-9.

［11］ Xu J H，Wang T，Wang X G，et al.PU.1 can regulate the ZNF300 promoter in APL-derived promyelocytes HL-60［J］.Leuk Res，2010，34(12):1636-46.

［12］ Wang T，Wang X G，Xu J H，et al.Overexpression of the human ZNF300 gene enhances growth and metastasis of cancer cells through activating NF-κB pathway［J］.J Cell Mol Med，2012，16(5):1134-45.

［13］彭仕芳，傅 蕾，譚德明.熱休克蛋白27高表達與肝細胞癌耐藥相關(guān)［J］.中華肝臟病雜志，2007，15(5):362-5.

［13］ Peng S F，F(xiàn)u L，Tan D M.Heat-shock protein 27 linked to multidrug resistance in human hepatic cancer cell lines［J］.J Chin Liver Dis，2007，15(5):362-5.