邵 倩，班 博，施錦繡

(1.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東濟南 250012;2.濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濟寧 272029;3.上海人類基因組研究中心，上海 201203)

磺脲類降糖藥物(SU)是一種胰島素促泌劑，SU進入人體后作用于胰島β細胞膜上的ATP敏感性鉀離子(KATP)通道［1］，該通道是由磺脲類受體1(SUR1)及鉀離子內(nèi)向整流通道(Kir6.2)兩種亞單位組成的異八聚體，通過將細胞膜電活動與細胞代謝聯(lián)系起來，在胰島素分泌中起著重要作用。長期應(yīng)用SU，會出現(xiàn)磺脲類藥物繼發(fā)性失效(SFS)［2］，具體機制目前尚不明確。本研究選擇調(diào)節(jié)KATP通道的SUR1、KCNJ11基因，采用SNaPshot技術(shù)對SUR1基因外顯子16-3c/t、KCNJ11基因E23K多態(tài)性進行基因分型，并探討與山東地區(qū)T2DM患者SFS的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 資料

1.1.1 受試對象 選取2010年11月～2012年7月在山東濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院的漢族T2DM患者200例(除外:糖尿病急性應(yīng)激狀態(tài)，如急性心肌梗死、腦卒中、糖尿病酮癥酸中毒、糖尿病非酮癥高滲性昏迷等;明顯的肝、腎功能異常者;近期使用過影響肝、腎功能藥物者)，診斷依據(jù)WHO1999年標(biāo)準(zhǔn)。SFS標(biāo)準(zhǔn):曾經(jīng)有至少3個月初始使用SU(或聯(lián)合二甲雙胍)的有效期，在適當(dāng)飲食、運動基礎(chǔ)上，SU加至每日最大劑量［如格列苯脲(優(yōu)降糖)15 mg、格列吡嗪(美吡達)30 mg等］，失效持續(xù)1～3個月，尚未使用 INS，空腹血糖 ＞10.0 mmol·L-1，糖化血紅蛋白＞9.0%。SU治療有效組:糖尿病飲食控制加 SU(或聯(lián)合二甲雙胍)空腹血糖 ＜9.0 mmol·L-1，糖化血紅蛋白＜8.4%。按照上述標(biāo)準(zhǔn)納入SFS組86例(男42例、女44例)，SU有效組114例(男63例，女51例)，兩組胰島細胞表面抗體(ICA)、胰島素抗體(IAA)和谷氨酸脫羧酶抗體(GAD-Ab)均陰性。所有對象在知情同意的情況下，簽署知情同意書。

1.1.2 臨床及生化數(shù)據(jù) 收集T2DM患者相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、糖尿病病程、飲食控制等，測量身高、體重，計算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)，BMI=體重/身高2(kg/m2)。采用全自動生化分析儀(日本HITACHI公司)測定各組的空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、餐后2h血糖(2 hours plasma glucose，2 hPG)、甘油三酯(triglycerides，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等指標(biāo)，采用單克隆抗體法檢測糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測空腹C肽(fasting C-peptide，F(xiàn)-C)及標(biāo)準(zhǔn)饅頭餐后2 h-C 肽(2 hours C-peptide，2 h-C)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有受檢者取肘靜脈血2ml，用EDTA-K2抗凝，采用鹽析法抽提全血基因組DNA(QIAGEN，Germany)，應(yīng)用 NanoDrop-1000(Nanodrop，USA)檢測其濃度和純度后，稀釋至30 μg·L-1。

1.2.2 SNaPshot技術(shù)檢測 (1)多重 PCR擴增:PCR 反應(yīng)體系為 10 μl，含基因組 DNA 1 μl(30 mg·L-1)，0.3 μl的 dNTP(10 mmol·L-1)，1 μl 10 ×PCR 緩沖液，0.52 μl MgCl2溶液(25 mmol·L-1)，0.1 μl HotStar(Sigma 公司)，6.68 μl無核酸酶的去離子水，各引物對的終濃度為 0.1 μmol·L-1。多重PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性15 min，94℃變性40 s，63℃退火1 min，每個循環(huán)下降0.5℃ ，72℃延伸1.5 min，15個循環(huán);94℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，25個循環(huán);72 ℃ 8 min，4 ℃保存，PCR反應(yīng)在9700熱循環(huán)儀(ABI公司)中進行。(2)擴增產(chǎn)物的純化:取1.0 μl擴增產(chǎn)物，加入2.0 U 蝦堿性磷酸酶(SAP 酶，USB，USA)，2.0 U ExoⅠ酶(Epicentre Biotechnologies，USA)，去離子水 2.6 μl，反應(yīng)總體系為 6 μl，混勻后 37 ℃保溫 60 min，然后75℃滅活15 min，4℃保存。(3)延伸標(biāo)記、純化，反應(yīng)體系為 5 μl，含純化產(chǎn)物 2 μl，SNaP-shot Multiplex Mix(ABI公司)0.5 μl，引物1.2 μl，去離子水1.3 μl，每種引物在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.2 μmol·L-1。PCR 循環(huán)條件為:96 ℃ 預(yù)變性10 s，96℃變性 10 s，50℃退火5 s，60℃ 延伸30s，25個循環(huán)，PCR反應(yīng)在9700熱循環(huán)儀(ABI公司)中進行。反應(yīng)結(jié)束后進行第2次純化，每反應(yīng)產(chǎn)物中加入1U SAP酶，37℃保溫60min，75℃滅活15 min，4℃保存。(4)每反應(yīng)體系中加入Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9.25 μl，內(nèi)標(biāo) LIZ-120(ABI公司)0.1 μl，第 2 次純化產(chǎn)物 1 μl，混勻離心后，95℃ 變性5 min，迅速冰冷4 min。于ABI公司3730遺傳分析儀進行毛細管電泳，應(yīng)用GeneMaperV 4.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。在所有樣本中，每一個SNP的基因分型成功率＞98%。在隨機抽取的樣本中所有的重復(fù)分型的一致率均為100%(Fig 1)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析以Hardy-Weinberg平衡法檢驗研究樣本的群體代表性，用χ2檢驗比較SFS組與有效組之間基因型及等位基因頻率分布。檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)分布情況，正態(tài)分布計量資料以±s表示，非正態(tài)分布的資料采用自然對數(shù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)后進行分析，結(jié)果以中位數(shù)(25%位數(shù)，75%位數(shù))表示，兩組臨床資料分析采用獨立樣本t或t＇檢驗。多因素分析用Logistic回歸分析。上述數(shù)據(jù)處理運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。

2 結(jié)果

2.1 SUR1 16-3c/t基因型和等位基因分布頻率SUR1基因外顯子16-3c/t基因型頻率在SFS組及有效組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，SUR1基因外顯子16-3c/t t/t、c/t和c/c基因型頻率在SFS組分別為53.5%、34.9%和11.6% ，在有效組分別為 28.9%、55.3%和 15.8%，兩組分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。SFS組“t”等位基因分布頻率明顯高于有效組(P＜0.01)，見Tab 1。

Fig 1 Genotyped result of SNaPshot

Tab 1 Distribution and frequency of SUR1，KCNJ11 genotypes and alleles between patients with secondary failure and without secondary failure

2.2 KCNJ11 E23K基因型和等位基因分布頻率KCNJ11基因多態(tài)性位點E23K基因型頻率在SFS組及有效組均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，SFS組 E23K KK、EK和 EE基因型頻率分別為11.6%、55.8% 和 32.6%，在有效組中分別為15.8%、60.5% 和 23.7%，兩組分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見Tab 1。

2.3 研究對象的臨床特點SFS組糖尿病病程、HbA1c、FPG、2 hPG 明顯高于有效組(P ＜ 0.01)，2 h-C肽明顯低于有效組(P＜0.01)，見Tab 2。

Tab 2 Analysis of clinical data in the 2 groups(±s)

Tab 2 Analysis of clinical data in the 2 groups(±s)

＊＊P ＜0.01 vs SU effective

Characteristics SU effective(n=114)SU failure(n=86)n(M/F)Age/y BMI/kg·m-2 Duration/y HbA1c/%FPG/mmol·L-1 2 hPG/mmol·L-1 F-C/nmol·L-1 2 h-C/nmol·L-1 TG/mmol·L-1 TC/mmol·L-1 HDL-C/mmol·L-1 LDL-C/mmol·L-1 86(42/44)56.9 ±8.7 25.4 ±3.3 10.0(6.0，14.0)＊＊10.8 ±1.6＊＊12.6 ±2.5＊＊20.6 ±3.5＊＊2.0 ±0.6 5.2 ±1.8＊＊2.0 ±0.8 4.9 ±1.3 1.2 ±0.3 2.8 ±0.7 114(63/51)56.2 ±9.4 25.0 ±2.6 4.0(2.0，8.0)7.8 ±0.4 7.6 ±1.0 16.8 ±3.1 2.1 ±0.7 7.9 ±2.3 2.2 ±0.8 4.9 ±0.7 1.2 ±0.2 2.8 ±0.8

2.4 SUR1基因外顯子16-3c/t各基因型的臨床及實驗室資料比較SUR1基因外顯子16-3c/t t/t基因型SFS發(fā)生率、FPG、HbA1c、2hPG明顯高于 c/t+c/c型組(P ＜0.01)，而 BMI、2h-C 肽明顯低于c/t+t/t型組(P ＜0.01)，見 Tab 3。

2.5 多因素Logistic回歸分析以SFS是否發(fā)生為因變量，校正性別、年齡、BMI、F-C 肽、TG、TC、HDL-C、LDL-C后，發(fā)現(xiàn)SUR1基因外顯子16-3c/t的t/t基因型是SFS的獨立危險因素(OR=2.82，95%CI=1.57 ～5.07，P ＜0.01)。在回歸中分別引入2 hPG(B)、2 h-C肽(C)、糖尿病病程(D)變量后，t/t基因型與SFS的相關(guān)性逐漸下降(均P＜0.05)，在回歸分析中引入糖尿病病程＞5年(E)變量后，SUR1基因外顯子16-3c/t的t/t基因型與SFS的相關(guān)性明顯增加(OR=3.90，95%CI=1.27 ～11.98，P ＜0.05)，見 Tab 4。

Tab 3 Clinical data in different genotypes of SUR1 gene exon 16-3c/t(±s)

Tab 3 Clinical data in different genotypes of SUR1 gene exon 16-3c/t(±s)

＊＊P ＜0.01 vs c/c+c/t group

Characteristics c/c+c/t t/t n(M/F)Age/y BMI/kg·m-2 Duration/y SFS/n(%)HbA1c/%FPG/mmol·L-1 2 hPG/mmol·L-1 F-C/nmol·L-1 2 h-C/nmol·L-1 121(64/57)57.1 ±9.9 25.7 ±3.0 6.0(2.0，10.0)40(33.1)8.8 ±1.4 9.2 ±2.4 17.8 ±3.7 2.1 ±0.7 7.2 ±2.6 79(41/38)55.7 ±7.6 24.4 ±2.6＊＊7.0(3.0，14.0)46(58.2)＊＊9.7 ±2.1＊＊10.5 ±3.7＊＊19.3 ±3.8＊＊2.0 ±0.7 6.1 ±2.2＊＊

Tab 4 Logistic regression analysis of SFS risk factors

3 討論

SU作為一種胰島素促泌劑，通過與胰島β細胞膜上的磺脲類藥物受體(SUR)結(jié)合，關(guān)閉細胞膜上KATP通道，使鉀離子外流減少，細胞膜去極化，導(dǎo)致電壓門控性鈣通道開放，鈣離子內(nèi)流，從而促進胰島素的釋放。近年來研究表明，KCNJ11、TCF7L2和IRS1等基因與 SFS有關(guān)［3-6］，但 SUR1基因與 SFS的關(guān)系報道較少。KCNJ11基因編碼KATP通道的內(nèi)向整流K+通道蛋白(Kir6.2)，SUR1基因編碼KATP通道的調(diào)節(jié)亞單位SUR1，二者均在調(diào)節(jié)胰島素的分泌中起著重要作用。

在本研究中，未發(fā)現(xiàn)KCNJ11基因E23K多態(tài)性與SFS相關(guān)(P＞0.05)，而在 UKPDS的研究中，也未發(fā)現(xiàn)E23K多態(tài)性與SU降糖療效相關(guān)［7］，提示在中國人群中該多態(tài)性可能與SU降糖療效無關(guān)。但是，本研究發(fā)現(xiàn)SUR1基因外顯子16-3c/t多態(tài)性與SFS發(fā)生相關(guān)(P ＜0.05)，且“t”危險等位基因分布頻率在 SFS組明顯高于有效組(OR=1.87，P＜0.05)，該結(jié)果與袁莉等［8］的研究結(jié)果一致，而與Zychma等［9］的報道不同，Zychma等分析陰性結(jié)果的主要原因是SFS患者中包含了一部分成人隱匿性自身免疫性糖尿病(LADA)，而非真正的T2DM。此外，外顯子 16-3c/t t/t基因型組的 FPG、2 hPG、HbA1c均明顯高于其他基因型組，而2 h-C肽明顯低于其他基因型組(P＜0.01)，提示t/t基因型攜帶者胰島素分泌能力可能受損。多因素Logistic回歸分析顯示t/t基因型是SFS發(fā)生的獨立危險因素(OR=2.82，P ＜0.01)，當(dāng)分別引入 2 hPG、2 h-C 肽后及糖尿病病程后，t/t基因型與SFS的相關(guān)性下降(OR 值分別為2.45、2.30 及 2.23，均 P ＜0.05)，考慮到較長的糖尿病病程可能會影響SU療效，對病程＞5年的患者進行逐步Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)t/t基因型仍是發(fā)生SFS的獨立危險因素(OR=3.90，P＜0.05)，這表明遺傳因素是SU降糖反應(yīng)個體差異的最主要原因，外顯子16-3c/t的t/t基因型攜帶者可能更易于發(fā)生SFS。推測可能機制:(1)由于該突變位于外顯子16剪切部位上游，在轉(zhuǎn)錄過程中，可能影響了正常的剪接，使SUR1功能受到影響，從而影響胰島素的釋放。(2)可能與ABCC8基因上發(fā)生變異的其他功能性位點存在強烈的連鎖不平衡［10］，影響了胰島素的分泌功能。

綜上所述，SUR1基因外顯子16-3c/t多態(tài)性可能與SFS相關(guān)。隨著SNPs的深入研究及藥物基因組學(xué)的發(fā)展，SUR1基因的多態(tài)性將極大地促進個體化用藥和新藥的研究。如何對患者針對性的用藥，避免或減少SFS風(fēng)險的發(fā)生以及對新藥的研發(fā)將成為我們今后的研究方向。

［1］ Bryan J，Crane A，Vila-Carriles W H，et al.Insulin secretagogues，sulfonylurea receptors and K(ATP)channels［J］.Curr Pharm Des，2005，11(21):2699-716.

［2］ 楊文英.磺脲類藥物應(yīng)用專家共識［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2004，20(4):附錄 4b-(1-4).

［2］ Yang W Y.Expert consensus of the application of sulfonylureas［J］.Chin J Endocrinol Metab，2004，20(4):Appendix 4b-(1-4).

［3］ Holstein A，Hahn M，Stumvoll M，et al.The E23K variant of KCNJ11 and the risk for severe sulfonylurea-induced hypoglycemia in patients with type 2 diabetes［J］.Horm Metab Res，2009，41(5):387-90.

［4］ Sesti G，Laratta E，Cardellini M，et al.The E23K variant of KCNJ11 encoding the pancreatic beta-cell adenosine 5＇-triphosphatesensitive potassium channel subunit Kir6.2 is associated with an increased risk of secondary failure to sulfonylurea in patients with type 2 diabetes［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91(6):2334-9.

［5］ Holstein A，Hahn M，K?rner A，et al.TCF7L2 and therapeutic response to sulfonylureas in patients with type 2 diabetes［J］.BMC Med Genet，2011，24(2):1-5.

［6］ Sesti G，Marini M A，Cardellini M，et al.The Arg972 variant in insulin receptor substrate-1 is associated with an increased risk of secondary failure to sulfonylurea in patients with type 2 diabetes［J］.Diabetes Care，2004，27(6):1394-8.

［7］ Gloyn A L，Hashim Y，Ashcroft S J，et al.Association studies of variants in promoter and coding regions of beta-cell ATP-sensitive K-channel genes SUR1 and Kir6.2 with Type 2 diabetes mellitus(UKPDS 53)［J］.Diabet Med，2001，18(3):206-12.

［8］ 袁 莉，鄭 娟，陳璐璐，等.SUR1基因多態(tài)性與磺脲類藥物療效的相關(guān)性［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2004，32(2):89-90.

［8］ Yuan L，Zheng J，Chen L L，et al.Relationship between SUR1 gene polymorphism and therapeutic responsiveness of sulfonylurea drug in type 2 diabetes［J］.J Huazhong Univ Sci Tech(Nat Sci Edit)，2004，32(2):89-90.

［9］ Zychma M J，Gumprecht J，Strojek K，et al.Sulfonylurea receptor gene 16-3 polymorphism-association with sulfonylurea or insulin treatment in type 2 diabetic subjects［J］.Med Sci Monit，2002，8(7):512-5.

［10］ Yokoi N，Kanamori M，Horikawa Y，et al.Association studies of variants in the genes involved in pancreatic beta-cell function in type 2 diabetes in Japanese subjects［J］.Diabetes，2006，55(8):2379-86.