朱蓓

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

以PTPN12為靶點(diǎn)的肝癌生物靶向治療初探

朱蓓

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

目的探討抑癌基因PTPN12在肝癌細(xì)胞系Hep-G2中生物治療肝癌的效果，揭示PTPN12在臨床應(yīng)用上的潛在意義。方法在Hep-G2細(xì)胞中順轉(zhuǎn)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTPN12基因后，通過MTT、Western Blot、熒光定量PCR分析抗腫瘤作用。結(jié)果轉(zhuǎn)染PTPN12后的Hep-G2細(xì)胞增殖慢，凋亡率高，PTPN12蛋白表達(dá)量高。結(jié)論P(yáng)TPN12基因在肝癌表達(dá)上調(diào)，能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，以PTPN12為靶點(diǎn)開展生物治療可能是一種新的治療手段。

PTPN12；生物治療；肝癌

肝癌是我國十大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重傷害國民身體健康[1]。近年來，隨著對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程的深入研究，一些新的治療手段和藥物被引入到肝癌治療中，如生物治療、細(xì)胞治療、靶點(diǎn)藥物等[2-3]。PTPN12是一種重要的抑癌基因，屬于酪氨酸磷酸酯酶家族，能正向調(diào)節(jié)RAS等通路[4-5]。PTPN12在乳腺癌中能抑制乳腺上皮增殖和轉(zhuǎn)化，抑制惡性腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，同時(shí)能抑制多種原癌酪氨酸激酶(包含HER2和EGFR等)[6]。本研究旨在探索PTPN12在肝癌中的抗腫瘤機(jī)制和以其為靶點(diǎn)的生物治療的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 Hep-G2細(xì)胞系購自ATCC；pcDNA3.1質(zhì)粒(購自Invitrogen)；轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD、G418(均購自Roche)；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(購自Gibco，Invitrogen)；RNA抽提試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(購自Roche)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Hep-G2培養(yǎng) Hep-G2細(xì)胞在37℃，5% CO2濃度下用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PTPN12基因 根據(jù)NCBI中 PNPT12的mRNA序列(序列號(hào)：NM_002835.2)，在三陰性乳腺癌組織中擴(kuò)增其基因全場，并亞克隆至pcDNA3.1載體中。所提取的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD的用量比例為2 μg：9 μl，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。順轉(zhuǎn)2 d后，收集一部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞，另一部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞中添加G418進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選。

1.2.3 MTT和AO/EB檢測 將上述所收集的細(xì)胞添加至6孔板和96孔板后，分別在培養(yǎng)24 h和48 h后吸取培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖劑(PBS)清洗，加入10 μl噻唑藍(lán)(MTT)染料，37℃孵育4 h，然后加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，再于37℃孵育5 min，酶標(biāo)儀570 nm處檢測。同時(shí)，進(jìn)行AO/EB雙染色，觀察Hep-G2細(xì)胞的凋亡變化。

1.2.4 熒光定量RT-PCR、Western Blot分析凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)量 在6孔板中提取正常和轉(zhuǎn)染PTPN12后的Hep-G2細(xì)胞總RNA，在檢測RNA的完整性后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量RT-PCR檢測。熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)條件：94°C 30 s，60°C 40 s，40個(gè)循環(huán)，并在60°C下收集熒光。表1為所用引物序列。對(duì)6孔板中的細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取(按照Roche產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作)，在獲得蛋白后，通過BCA蛋白定量試劑盒對(duì)其進(jìn)行定量。隨后，進(jìn)行Western Blot檢測PTPN12和β-actin蛋白變化。

表1 所用引物名稱及引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料組間比較采用配對(duì)t檢測分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hep-G2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PTPN12促進(jìn)Hep-G2細(xì)胞進(jìn)入凋亡 Hep-G2細(xì)胞在經(jīng)PTPN12轉(zhuǎn)染后通過MTT檢測細(xì)胞增殖(圖1)：轉(zhuǎn)染后的Hep-G2細(xì)胞其增殖明顯放慢，低于正常Hela細(xì)胞。而AO/EB染色固定后的Hep-G2細(xì)胞則反映出細(xì)胞的凋亡情況，轉(zhuǎn)染PTPN12后的Hep-G2細(xì)胞其凋亡率最高。

圖1 Hep-G2細(xì)胞PTPN12轉(zhuǎn)染前、后增殖情況

2.2 Hep-G2細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 PTPN12后PTPN12基因mRNA和蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染PTPN12后的Hep-G2細(xì)胞、正常Hela細(xì)胞的PTPN12基因表達(dá)量如圖2所示。上述兩種細(xì)胞的PTPN12蛋白表達(dá)量如圖3所示。

圖2 PTPN12轉(zhuǎn)染Hep-G2細(xì)胞后PTPN12基因表達(dá)變化

圖3 PTPN12轉(zhuǎn)染Hep-G2細(xì)胞后PTPN12蛋白表達(dá)變化

3 討論

PTPN12是近年來頗受關(guān)注的一個(gè)新型抑癌基因，其在細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移、增殖等方面具有重要作用，也與酪氨酸磷酸化具有關(guān)鍵作用[7]。PTPN12屬于蛋白酪氨酸磷酸化家族，其在大腦等多種組織中具有高表達(dá)，其抑制腫瘤的作用則是通過MAPK去磷酸化來實(shí)現(xiàn)。除此以外，PTPN12還參與到細(xì)胞骨架和信號(hào)蛋白途徑中，例如小GTP酶、FAK、CAS等[8-9]。雖然發(fā)現(xiàn)PTPN12在治療三陰性乳腺癌中具有明顯的作用，但是其抗腫瘤機(jī)制目前還不是完全清楚。本文旨在研究其在肝癌細(xì)胞系Hep-G2中的可能的抗腫瘤應(yīng)用。

本文研究發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染PTPN12基因后，Hep-G2細(xì)胞的凋亡率明顯增加，且凋亡率的增加幅度明顯。這揭示了以PTPN12作為靶點(diǎn)的生物治療途徑可能成為一種新的治療肝癌方法。

[1]Liovet JM,Bruix J.Molecular targeted therapies in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2008,48(4)∶1312-1327.

[2]De Roock W.Effects of KRAS,BRAF,NRAS and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy inchemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer∶a retrospective consortium analysis[J].Lancet Oncol,2010,8∶753-762.

[3]Tonks NK.Protein tryrosine phosphatases∶form genes,to function, to disease[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2006,7∶833-846.

[4]Lucci MA,Orlandi R,Triulzi T.Expression profile of tyrosine phosphatases in HER2 breast cancer cells and tumors[J].Cell Oncol, 2010,32∶361-372.

[5]Cosimo D,Baselga S.Management of breast cancer with targeted agents∶importance of heterogeneity[J].Nat Rev Clin Oncol,2010, 7∶139-147.

[6]Sun TT,Aceto N.Activation of multiple proto-oncogenic tyrosine kinases in breast cancer via lossof the PTPN12 Phosphatase[J]. Cel,2011,144∶703-718.

[7]Lucci MA,Orlandi R.Expression profile of tyrosine phosphatases in HER2 breast cancer cells and tumors[J].Cell Oncol,2010,32∶361-372.

[8]Sastry SK,Lyons K.PTP-PEST controls motility through regulation of Rac1[J].J Cell Sci,2002,115∶4305-4316.

[9]Espejo R,Rengifo W.PTP-PEST controls motility,adherens junction assembly,and Rho GTPase activity in colon cancer cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol,2010,299∶454-463.

Bio-therapy effect of PTPN12 on liver cancer.

ZHU Bei.School of Medical Technology,Taizhou Polytechnic College, Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the anti-tumor effect of PTPN12 in Hep-G2 cells,and to reveals the hidden meaning of PTPN12 in the clinical application.MethodsThe PTPN12 gene was transfected into Hep-G2 cells,and then the anti-tumor effect was analyzed by Real-time RT-PCR,Western Blot,and MTT.ResultsIncreasing PTPN12 expression in Hep-G2 cells were observed.The proliferation of Hep-G2 cells was inhibited,and the apoptosis rate was high.ConclusionPTPN12 may be a novel strategy for bio-therapeutic regents in liver cancer,which can effectively inhibit the growth of tumor cells and promote apoptosis.

PTPN12;Bio-therapy;Liver cancer

R735.7

A

1003—6350（2013）09—1264—02

doi∶10.3969/j.issn.1003-6350.2013.09.0534

朱 蓓。E-mail：pigbaby1577@sina.com

2012-11-21)

·論 著·