楊明璨，朱楚洪 (第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部人體解剖學(xué)教研室，重慶400038)

聚氨基甲酸酯簡稱為聚氨酯(PU)，是由有機(jī)二異氰酸酯或多異氰酸酯與二羥基或多羥基化合物加聚而成。因具有優(yōu)良的物理機(jī)械性能和良好的生物相容性，目前在許多人工器官和醫(yī)療裝置中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［1］。但是在臨床上，聚氨酯依然會帶來如血栓形成等類似的不良生物反應(yīng)，因此，對其進(jìn)行改性獲得更加優(yōu)良的生物相容性的聚氨酯材料是非常必要和有意義的［2］。已有研究表明通過在疏水性材料表面嫁接親水性物質(zhì)能有效的減少和降低這種作用，從而抑制凝血現(xiàn)象的發(fā)生［3］。在眾多的親水性改性材料中，聚乙二醇因能夠有效的防止蛋白吸附和血小板的粘附而被受親睞［4-5］。因此，本研究采用兩步法將不同分子量的PEG 修飾到PU 膜上，而后考察其凝血因子試驗、復(fù)鈣時間、血小板計數(shù)和血細(xì)胞計數(shù)實驗，檢測不同分子量修飾的PU 膜的血液相容性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

聚乙二醇400、聚乙二醇800、聚乙二醇1000和聚乙二醇2000(Aldrich 公司)，4，4-二苯甲基二異氰酸酯(MDI，Aldrich 公司)，琥珀亞胺碳酸二酯(DSC，Aldrich 公司)，甲苯，DMF，聚氨酯均為國藥試劑，分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 純化PU 以及制膜 為了去除PU 膠粒中的添加劑和其他雜質(zhì)，首先在Soxhelt 中使用乙醇提取48 h，然后放在真空干燥箱中，50 ℃下干燥24 h 以去除乙醇。將干燥的提純的3 g PU 溶解于30 mL 的DMF 中，然后倒入培養(yǎng)皿中后置于干燥箱中，65 ℃下加熱2 d 使其成膜。而后將其轉(zhuǎn)入真空干燥箱中，65 ℃下繼續(xù)干燥24 h 以除去微量殘余的溶劑。用打孔器將干燥的膜敲成固定體積的圓形膜片。

1.2.2 不同分子量的 PEG 修飾PU 膜 在N2保護(hù)下，將 PU膜片置于7.5%(wt/v)的MDF/無水甲苯中，緩慢滴加三乙胺，在甲苯中的含量大約為2.5%(wt/v)，在50 ℃下反應(yīng)2 h，獲得PU-NCO 膜，最后用無水甲苯對膜進(jìn)行清洗，去除膜表面物理吸附的MDI。將PU-NCO 膜轉(zhuǎn)移到5%(wt/v)的不同分子量的PEG/甲苯溶液中，在N2保護(hù)下，50 ℃下反應(yīng)2 h，后取出膜并用甲苯和乙醇洗去表面粘有的未反應(yīng)的PEG，在真空干燥將膜烘干，便得到了PEG400-PU、PEG800-PU、PEG1000-PU、PEG2000-PU 的膜。

1.2.3 凝血因子試驗 凝血因子測定采用凝血法，在試管中先后加入健康成人鮮血3 mL 和不同分子量PEG 修飾的0.074 g材料，經(jīng)8 min 后用全自動生化分析儀進(jìn)行測定。

1.2.4 復(fù)鈣時間測定 復(fù)鈣時間的測定采用第一條絲狀物出現(xiàn)的時間，具體方法是在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的NaCl 溶液中放入不同分子量 PEG 修飾的 0.2 cm ×0.2 cm 材料，浸泡 24 h，然后將浸泡的材料、0.2 mL 的血漿和 0.025 mol/L CaCl2溶液先后移至試管內(nèi)，37 ℃恒溫。

1.2.5 血小板計數(shù) 血小板的分析采用全自動血細(xì)胞分析儀，具體的操作方法:將不同分子量PEG 修飾的3 cm×3 cm 材料浸入0.5 mL 新鮮的兔血中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8%的檸檬酸三鈉［9︰1(w/w)］，30 min 后用 pH =7.2 的磷酸鹽洗去吸附不牢固的血小板，用戊二醛固定30 min，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% ～100%的7 個梯度下的乙醇水溶液脫水15 ～30 min，在超凈環(huán)境下自然干燥并用瑞氏染色劑染色。

1.2.6 血細(xì)胞計數(shù) 血細(xì)胞的計數(shù)主要是針對白細(xì)胞和紅細(xì)胞，采用自動血細(xì)胞分析儀來計算。具體方法是:將不同分子量PEG 修飾的0.074 g 材料和3 mL 健康成人靜脈血放入裝有EDTA 抗凝劑的試管中，8 min 后測定。

2 結(jié)果

2.1 不同PU 的凝血因子和復(fù)鈣時間

從圖1 和圖2 中可以看出，隨著修飾劑PEG 分子量的增加，凝血因子IV 的消耗量在不斷下降，而復(fù)鈣時間在不斷增加。但是當(dāng)分子量達(dá)到1000 后，其凝血因子IV 的消耗量和復(fù)鈣時間的增幅都明顯放緩。凝血因子IV 和Ca2+在激活血小板中起著非常關(guān)鍵的作用，通過PEG 的修飾，能有效的減少復(fù)鈣時間和降低凝血因子IV。這是因為，PEG 具有疏水性，經(jīng)過修飾后，PU 膜的親水性提高，可有效的延緩對凝血因子的激活，因此表現(xiàn)出了隨著修飾劑PEG 分子量的增加，復(fù)鈣時間延長和凝血因子消耗量降低［6］。

2.2 不同PU 的血小板吸附量實驗

圖1 不同PU 凝血因子Ⅳ(Ca2+)消耗量

圖2 不同PU 復(fù)鈣時間

人體受物理損傷后，血小板會受到損傷部位激活因素的刺激，出現(xiàn)血小板的聚集，成為血小板凝塊，起到初級止血作用。接著血小板又經(jīng)過復(fù)雜的變化產(chǎn)生凝血酶，使鄰近血漿中的纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，互相交織的纖維蛋白使血小板凝塊與血細(xì)胞纏結(jié)成血凝塊，即血栓。同時血小板的突起伸入纖維蛋白網(wǎng)內(nèi)，血小板微絲(肌動蛋白)和肌球蛋白的收縮使血凝塊收縮，血栓變得更堅實，能更有效地起止血作用，這是二級止血作用。因此，血小板是參與凝血過程的一種很重要的物質(zhì)。當(dāng)醫(yī)用材料和血液接觸后，血漿蛋白之間會發(fā)生競爭性的吸附，而血小板就會貼壁在吸附在材料表面的血漿蛋白，當(dāng)達(dá)到一定量的時候，血小板就會聚集，形成血栓。二相聚集發(fā)生時纖維蛋白原變成纖維蛋白，導(dǎo)致凝血。因此，幾乎所有的醫(yī)用材料改性其目的都是有效地降低血小板的吸附量，不激活凝血途徑［7-8］。

從圖3 中可以看出，隨著修飾劑PEG 分子量的增加，血小板的吸附量在逐漸的降低，說明了PEG 分子量的增加能有效的減少血小板的吸附量。從圖3 中也可以看出，當(dāng)PEG 的分子量達(dá)到1 000 時，血小板的吸附量增加速率就放緩了，當(dāng)PEG 的分子量達(dá)到2 000 時，和1 000 時相差不大。不同分子量PEG修飾的PU 膜能有效地降低血小板的吸附量，與PEG 親水特性有著密切的關(guān)系，在一定程度下，隨著親水性的增加，一方面是由于吸附在材料表面的血漿蛋白降低，而血小板必須吸附在血漿蛋白上才能發(fā)揮作用，由于附著位點的減少導(dǎo)致了血小板吸附量的降低。另一方面是修飾的親水性的PEG 直接導(dǎo)致血小板吸附量的降低［9］。

圖3 不同PU 血小板吸附量

2.3 不同PU 的血細(xì)胞計數(shù)實驗

從4 種不同分子量的PEG 修飾的PU 膜來看，隨著PEG 分子量的增加，紅細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)目都在明顯降低，而白細(xì)胞數(shù)目也一直明顯低于紅細(xì)胞數(shù)目。血細(xì)胞數(shù)目的降低反應(yīng)了材料和血液的兼容性。血細(xì)胞數(shù)目的降低有利于減少血栓的形成。

圖4 不同PU 血液中白細(xì)胞和紅細(xì)胞的數(shù)目

3 討論

本實驗將PU 純化后，用4，4-二苯甲基二異氰酸酯形成PU-NCO 膜，將 PU-NCO 膜和PEG 反應(yīng)形成分子量 400、800、1 000 和 2 000 的 PEG-PU 膜，該過程采用PEG 進(jìn)行修飾，由于PEG 具有親水性，經(jīng)過修飾后，能使PU 膜的親水性提高，可有效的延緩對凝血因子的激活，表現(xiàn)出隨著修飾劑PEG 分子量的增加，復(fù)鈣時間的延長和凝血因子消耗量的降低，從而有效的減少復(fù)鈣時間和降低凝血因子IV。人類血小板是參與凝血過程的一種很重要的物質(zhì)。當(dāng)普通醫(yī)用材料和血液接觸后，血漿蛋白之間會發(fā)生競爭性的吸附，而血小板就會貼壁在材料表面的血漿蛋白上，當(dāng)達(dá)到一定量的時候，血小板就會發(fā)生聚集，形成血栓，二相聚集發(fā)生時纖維蛋白原變成纖維蛋白，導(dǎo)致凝血。因此，有效的降低血小板的吸附量，且不激活凝血途徑是幾乎所有的醫(yī)用材料改性的目的。本實驗通過血小板計數(shù)和血細(xì)胞計數(shù)實驗，檢測不同分子量PEG 修飾后PU 膜的血液相容性。實驗結(jié)果表明修飾后的PU 膜能有效的降低的血小板的吸附量，這和PEG 親水特性有著密切的關(guān)系。在一定環(huán)境中，一方面血小板必須吸附在血漿蛋白上才能發(fā)揮凝集作用，隨著經(jīng)修飾后的PU膜親水性增加，吸附在材料表面的血漿蛋白濃度降低，從而導(dǎo)致了血小板吸附量的降低。另一方面，有研究表明修飾的親水性PEG 可以直接導(dǎo)致血小板吸附量的降低［9-10］。通過分析，經(jīng)過 PEG 修飾后的 PU 膜，凝血因子吸附數(shù)量降低，復(fù)鈣時間延長，血細(xì)胞和血小板吸附量隨著PEG 分子量的增加而降低，這種PU 膜和血液相容性得到了明顯改善，并且隨著分子量的增加，這種相容性也在增加，當(dāng)PEG 的分子量為1 000 時，這種效果就達(dá)到最高。這種經(jīng)過PEG 修飾后的PU 膜在抗血液凝集方面明顯優(yōu)于普通PU 膜。

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