毛 磊，朱昱哲，張維剛，王靜鳳

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266003）

已有研究表明肝臟脂類物質(zhì)（尤其是TG）蓄積會引起非酒精性脂肪肝[1-2]（nonalcoholic fatty liver，NAFLD），對人類健康構(gòu)成巨大威脅。由于其發(fā)病機(jī)制尚不明確，綜合治療藥物還未上市[3]。膳食和營養(yǎng)對非酒精性脂肪肝的形成有重要影響，如何通過飲食調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝預(yù)防此疾病的發(fā)生，已成為科研工作者研究的熱點(diǎn)。

DHA/EPA是海產(chǎn)魚油的有效成分，具有明顯降血脂和降膽固醇的作用[4]，魚油中其他的n-3多不飽和脂肪酸以及脂溶性維生素等在此方面的作用不顯著。目前實(shí)驗(yàn)用魚油多為DHA/EPA含量14%～30%的甘油酯形式和DHA/EPA含量50%～70%的乙酯形式。乙酯型魚油DHA/EPA含量雖高，但只有轉(zhuǎn)化為甘油三酯才能被人體吸收，因此生物利用率低；甘油三酯型魚油雖然易被人體消化吸收[5-6]，但是DHA/EPA含量較低。因此，高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油的研究得到越來越多科研學(xué)者的重視。本實(shí)驗(yàn)首次以通過酶法催化轉(zhuǎn)化技術(shù)制得的高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油為研究對象，觀察其對實(shí)驗(yàn)性脂肪肝大鼠脂質(zhì)代謝的影響，為其高值化開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙酯型（5%TG（22%DHA+33%EPA），90%以上Et（乙酯））和低含量DHA/EPA甘油三酯型魚油（100%TG（12%DHA+18%EPA）） 均為浙江舟山神州海洋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油（70%TG（22%DHA+33%EPA），25%DG（甘油二酯），5%MG（甘油一酯）） 由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與人類健康實(shí)驗(yàn)室孫兆敏博士提供；健康SPF級雄性W istar大鼠 體重（200±10）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2007-0001；乳清酸 上海寶曼生物科技有限公司產(chǎn)品；非諾貝特 法國利博福尼制藥公司產(chǎn)品，批號H 20100602；干酪素 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；微晶纖維素 曲阜市天利藥用輔料有限公司產(chǎn)品；大豆油 煙臺益海糧油工業(yè)有限公司產(chǎn)品；玉米淀粉 諸城興貿(mào)玉米開發(fā)有限公司產(chǎn)品；蔗糖 CJ第一制糖株式會社產(chǎn)品；DL-蛋氨酸 Sigma公司產(chǎn)品；TritonX-100 美國Am resco公司產(chǎn)品；總膽固醇試劑盒和甘油三酯試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品；其他試劑國產(chǎn)分析純。

Model680型酶標(biāo)儀 美國Bio RAD公司產(chǎn)品；GL-20M型高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；CAV114C型電子天平 OHAUS公司產(chǎn)品；HH-8型電熱恒溫水浴鍋 金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品；MDF-U52V型超低溫冰箱 大連SANYO公司產(chǎn)品；LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司產(chǎn)品；ALPHA 1-4 LO型凍干機(jī) 德國CHRIST公司產(chǎn)品；6890N型氣相色譜儀 美國Aglient公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 飼料配制 動(dòng)物飼料按照20%總蛋白質(zhì)和10%油脂含量進(jìn)行配制，飼料中其他成分參照AIN93標(biāo)準(zhǔn)配方[7]，除正常組外，飼料中均添加1.0%乳清酸。

1.2.2 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn) 雄性W istar大鼠按體重隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組、乙酯型魚油對照組、低含量DHA/EPA甘油三酯型魚油對照組和高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油低、中、高劑量組，每組10只。正常對照組飼喂常規(guī)飼料，其他組飼喂添加乳清酸的飼料造模。乙酯型對照組灌胃乙酯型魚油（1.47g/kg·bw），低含量DHA/EPA甘油三酯型對照組灌胃低含量DHA/EPA甘油三酯型魚油（2.70g/kg·bw），劑量組分別灌胃高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油（0.74、1.48、2.96）g/kg·bw，陽性對照組灌胃非諾貝特（0.09g/kg·bw），正常和模型對照組灌胃生理鹽水，1次/d。實(shí)驗(yàn)周期為20d。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由進(jìn)食和飲水。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前4d，分別收集大鼠糞便，凍干待測；于末次給藥后，禁食不禁水10h，以乙醚麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取全血，分離血清；仔細(xì)剝離肝臟，稱重，于-80℃保存，備用。

1.2.3 血清脂質(zhì)含量的測定 按試劑盒方法測定TC和TG含量。

1.2.4 肝臟脂質(zhì)含量的測定 參照Cha JY等方法[8]，制備肝臟勻漿，以氯仿和甲醇混合液（體積比2∶1）抽提肝臟脂質(zhì)，TC和TG含量分別參照試劑盒方法檢測。

1.2.5 肝臟中脂肪酸組成及含量的測定 取0.25g肝臟，參照Folch等方法[9]提取肝臟中總脂質(zhì)，肝臟總脂質(zhì)經(jīng)皂化后，HCl-甲醇法進(jìn)行甲酯化，使用氣相色譜儀進(jìn)行脂肪酸組成分析。工作條件為：色譜柱：INNOWax毛細(xì)管柱（30m×0.32mm×0.25μm，USA）；FID檢測器：進(jìn)樣口溫度240℃，檢測器溫度250℃，柱溫170～210℃，升溫速率3℃/m in，210℃保留30m in。

1.2.6 糞便中脂質(zhì)含量的測定 參照Folch等方法[9]，抽提糞便中脂質(zhì)。糞便中總脂質(zhì)含量采用重量法檢測，TC含量參照試劑盒方法檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 對大鼠血清脂質(zhì)含量的影響

表1結(jié)果顯示，模型對照組大鼠血清TC和TG含量較正常對照組均顯著降低（p＜0.01），說明乳清酸嚴(yán)重?cái)_亂了大鼠的脂質(zhì)代謝。灌胃不同劑量高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能降低模型大鼠血清TC和TG含量，與模型對照組相比分別平均降低15.42%（p＜0.05）和8%。說明高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能顯著降低模型大鼠血脂水平。

表1 魚油對大鼠血清脂質(zhì)含量的影響（n=10，±s）Table1 Effects of fish oil on serum lipids concentration in rats（n=10，±s）

表1 魚油對大鼠血清脂質(zhì)含量的影響（n=10，±s）Table1 Effects of fish oil on serum lipids concentration in rats（n=10，±s）

注：#：p＜0.05，##：p＜0.01，與正常對照組相比較；*：p＜0.05，**：p＜0.01，與模型對照組相比較；表2～表4同。

分組 TC（mmol/L）TG（mmol/L）正常對照組 2.10±0.31 0.53±0.06模型對照組 1.47±0.19##0.25±0.07##陽性對照組 1.21±0.21* 0.63±0.15**乙酯型對照組 1.34±0.27 0.24±0.04低含量DHA/EPA甘油三酯對照組 1.31±0.40 0.24±0.05低劑量組 1.43±0.27 0.24±0.08中劑量組 1.23±0.38 0.23±0.08高劑量組 1.07±0.21* 0.22±0.08

2.2 對大鼠肝臟脂質(zhì)含量的影響

結(jié)果見表2。與正常對照組相比，模型對照組肝臟TC和TG含量分別平均升高73.86%（p＜0.01）和677.17%（p＜0.01），說明添加1%乳清酸成功誘導(dǎo)產(chǎn)生非酒精性脂肪肝模型。灌胃不同劑量高含量DHA/ EPA甘油三酯型魚油，能顯著降低模型大鼠肝臟TC和TG含量，與模型對照組相比分別平均降低13.39%（p＜0.01）和45.20%（p＜0.01）。說明高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能有效降低肝臟脂質(zhì)水平。

2.3 對大鼠肝臟脂肪酸組成的影響

表3結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型對照組大鼠肝臟SFA（飽和脂肪酸）含量顯著降低（p＜0.01）；MUFA（單不飽和脂肪酸）含量顯著升高（p＜0.01）。與模型對照組相比，高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油組大鼠肝臟PUFA（多不飽和脂肪酸）、SFA、DHA和EPA含量分別平均升高10.79（p＜0.01）、3.27%、518.23%（p＜0.01）和312.78%（p＜0.01）；MUFA含量平均降低19.63%（p＜0.01）。以上分析表明，高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能使大鼠肝臟PUFA、MUFA和SFA含量趨向正常水平，而且可以顯著提高大鼠肝臟DHA/EPA含量。

表2 魚油對大鼠肝臟脂質(zhì)含量的影響（n=10，±s）Table2 Effects of fish oil on hepatic lipids concentration in rats（n=10，±s）

表2 魚油對大鼠肝臟脂質(zhì)含量的影響（n=10，±s）Table2 Effects of fish oil on hepatic lipids concentration in rats（n=10，±s）

分組 TC（mg/g） TG（mg/g）正常對照組 8.99±0.91 23.43±1.40模型對照組 15.63±1.78## 182.09±9.93##陽性對照組 5.62±0.32** 9.04±2.10**乙酯型對照組 14.87±1.14 114.89±8.93**低含量DHA/EPA甘油三酯對照組 15.24±1.84 102.86±8.51**低劑量組 14.39±1.24 107.92±10.01**中劑量組 13.39±1.40** 105.16±6.95**高劑量組 12.83±2.03** 86.30±6.16**

2.4 對大鼠糞便脂質(zhì)含量的影響

結(jié)果見表4。模型對照組大鼠糞便總脂和TC含量較正常對照組均顯著升高（p＜0.01）。高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能顯著提高糞便總脂和TC含量，與模型對照組相比分別平均提高69.36%（p＜0.01）和14.28%（p＜0.01）。說明高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能有效促進(jìn)總固醇的代謝并抑制脂質(zhì)的吸收。

3 結(jié)論與討論

表3 魚油對大鼠肝臟脂肪酸組成的影響（n=6，±s）Table3 Effects of fish oil on hepatic fatty acid composition（n=6，±s）

表3 魚油對大鼠肝臟脂肪酸組成的影響（n=6，±s）Table3 Effects of fish oil on hepatic fatty acid composition（n=6，±s）

組別 正常組 模型組 陽性組 乙酯組 低DHA/EPA甘油三酯組 低劑量組 中劑量組 高劑量組14∶0 0.48±0.08 0.45±0.07 0.47±0.08 0.40±0.05 0.42±0.08 0.39±0.08 0.37±0.08 0.29±0.05** 16∶0 20.58±1.49 23.21±1.04## 23.22±2.12## 23.48±1.27 23.65±1.27 23.26±1.85 23.74±2.31 21.84±1.43 16∶1 1.25±0.36 2.06±0.57## 1.23±0.22** 1.51±0.28** 1.40±0.30** 1.47±0.42** 1.38±0.43** 1.16±0.25** 18∶0 14.78±1.90 6.04±0.74## 8.56±0.68** 5.16±0.69 7.09±0.86 6.72±1.39 7.32±1.30* 8.34±1.47** 18∶1 17.07±2.08 26.05±2.25## 24.71±2.36 22.53±2.26** 19.45±2.21** 22.24±1.50** 21.01±3.58** 18.92±2.07** 18∶2 22.75±2.46 30.84±1.86## 28.65±2.49 30.14±3.98 28.26±2.10 29.23±2.41 26.40±4.29** 25.51±2.81** 20∶4 19.19±2.00 8.81±0.66## 9.78±0.96 5.58±1.52** 5.55±0.67** 6.17±0.86** 5.48±0.70** 6.30±1.02** 20∶5 0.98±0.25 1.33±0.28 1.26±0.33 4.04±0.98** 6.25±1.32** 4.80±1.10** 5.82±1.47** 5.85±1.78** 22∶6 2.87±0.49 1.17±0.25## 2.12±0.24 4.91±0.69** 7.89±1.98** 5.69±1.28** 6.94±1.15** 9.07±2.78** SFA 35.85±1.68 29.70±1.05## 32.25±2.10 29.72±1.27 31.17±1.61 30.37±1.80 30.76±1.75 30.88±1.06 MUFA 18.33±2.32 28.11±2.38## 25.94±2.36 25.08±1.14* 20.86±2.33** 23.71±1.76** 23.33±2.19** 20.74±1.39** PUFA 46.48±1.57 42.17±1.53 41.81±2.64 45.19±1.22* 47.96±2.29** 45.90±2.58** 45.89±1.54** 48.37±1.37**

本實(shí)驗(yàn)向飼料中添加1%乳清酸，致使脂質(zhì)在肝臟中積累，形成非酒精性脂肪肝。已有研究表明，通過在大鼠飼料中添加1%乳清酸，可在3～10d誘導(dǎo)產(chǎn)生脂肪肝模型[10-11]，乳清酸引起的肝臟TG積累與肝臟脂肪合成增加有關(guān)[11-12]。王玉明等[13]已證明，給大鼠飼喂1%的乳清酸，可促進(jìn)肝臟TC和TG合成，形成脂肪肝，并對乳清酸誘導(dǎo)產(chǎn)生脂肪肝的機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)的闡明。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，因此實(shí)驗(yàn)建立的乳清酸誘導(dǎo)大鼠脂肪肝模型可靠。

表4 魚油對大鼠糞便總脂和TC含量的影響（n=10，±s）Table4 Effects of fish oil on the contentof total lipid and TC of fecal in rats（n=10，±s）

表4 魚油對大鼠糞便總脂和TC含量的影響（n=10，±s）Table4 Effects of fish oil on the contentof total lipid and TC of fecal in rats（n=10，±s）

分組 總脂（mg/d） TC（μmol/d）正常對照組 27.93±5.84 6.24±0.48模型對照組 35.00±8.24## 9.13±1.17##陽性對照組 21.02±1.40** 10.38±1.65*乙酯型對照組 51.34±6.89** 10.43±1.35*低含量DHA/EPA甘油三酯對照組 51.34±6.89** 10.85±1.20**低劑量組 62.59±3.91** 9.80±0.56中劑量組 56.76±3.27** 10.23±1.27*高劑量組 58.48±4.50** 11.27±1.06**

現(xiàn)已確認(rèn)，肝臟中脂質(zhì)含量異常升高會導(dǎo)致脂肪肝的產(chǎn)生及肝臟功能的損傷。高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能有效改善大鼠血脂水平，減少肝臟TC和TG的蓄積，提示高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能顯著調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝，有效預(yù)防非酒精性脂肪肝的形成。諸多研究表明，DHA/EPA可以促進(jìn)機(jī)體膽固醇的代謝，對動(dòng)脈粥樣硬化具有預(yù)防和改善作用[4]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，灌胃高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油后，劑量組大鼠肝臟中DHA/EPA含量顯著提高（p＜0.01），提示高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油對大鼠脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用與其豐富的甘油三酯型DHA/EPA有關(guān)。灌胃高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油后，劑量組大鼠糞便中總脂質(zhì)和膽固醇含量顯著增加（p＜0.01，p＜0.05），提示高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能抑制大鼠消化道內(nèi)甘油三酯和膽固醇的吸收。由此可見，抑制消化道內(nèi)甘油三酯和膽固醇的吸收是高含量DHA/EPA甘油三酯調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝的重要途徑。

綜上所述，高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油能有效調(diào)節(jié)大鼠脂質(zhì)代謝，顯著改善其代謝紊亂的情況，本研究為其高效高值利用提供了科學(xué)依據(jù)。有關(guān)高含量DHA/EPA甘油三酯型魚油調(diào)節(jié)大鼠脂質(zhì)代謝的機(jī)理尚在進(jìn)一步研究中。

[1]Schaffner F，Thaler H.Nonalcoholic fatty liver disease[J].Prog Liver Dis，1986（8）：283-98.

[2]Kotronen A，Hannele.Fatty Liver-A Novel Component of the Metabolic Syndrome Arterioscler[J].Thromb Vasc Biol，2007，28：27-38.

[3]姚紅銳.非酒精性脂肪肝中脂肪酸合成通路研究及治療進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010（8）：107-108.

[4]Kinsella J E.Food Components with Potential Therapeutic Benefits：The n-3 Polyunsaturated Fatty Acids of Fish Oil[J].Food Technol，1986，40（2）：89-97.

[5]Lawson L D，Hughes B G.Human Absorption of Fish Oil Fatty Acids as Triacylglycerols，F(xiàn)ree Acids，or Ethyl Esters[J].Biochem Biophys Res Commun，1988，152（1）：328-335.

[6]SHEN Zhiping，CHAKRA W J.Effects of docosahexaenoic acid positional distribution on the oxidative stability of model triacylglycerol in water emulsion[J].Journal of Food Lipids，2009，16（1）：62-71.

[7]Reeves pH，Nielsen FH，F(xiàn)ahey GC.AIN-93 purified diets for laboratory rodents：final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet[J].JNutr，1993，123（11）：1939-1951.

[8]Cha JY，Mameda Y，Yamamoto K，et al.Association between hepatic triacylglycerol accumulation induced by administering orotic acid and enhanced phosphatidate phosphohydrolase activity in rats[J].Biosci Biotechnol Biochem，1998，62：508.

[9]Folch J，Lees M，Stanley G H.A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues[J].J Biol Chem，1957，226：497-509.

[10]Harden KK，Robinson JL.Hypocholesteremia induced by orotic acid：dietary effects and species specificity[J].J Nutr，1984，114：411-421.

[11]Griffin JL，Bonney SA，Mann C，et al.An integrated reverse functional genomic and metabolic approach to understanding orotic acidinduced fatty liver[J].Physiol Genomics，2004，17：140-149.

[12]楊月欣.食物營養(yǎng)成分速查[M].北京：人民日報(bào)出版社，2006：253-255.

[13]王玉明，王靜鳳，薛長湖.乳清酸誘導(dǎo)大鼠脂肪肝的機(jī)制研究[J].營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2009，31（4）：330-338.