孔令聰，張春艷，高云航，馬紅霞，3*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春130118;2.文登市張家產(chǎn)畜牧獸醫(yī)工作站，山東文登 264407;3.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130118)

牛支原體(Mycoplasma bovis，M.bovis)是能引起牛支原體肺炎和乳房炎的病原，于1961年首次從患有乳房炎的病牛中分離［1］，1976年被報(bào)道與牛呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)［2－3］。近年來，該病原在世界范圍內(nèi)呈快速傳播態(tài)勢(shì)［4－6］。辛九慶等［7］首次在我國(guó)從犢牛肺臟中分離得到牛支原體。繼而，國(guó)內(nèi)部分地區(qū)新從外地引進(jìn)的肉牛均爆發(fā)了牛支原體肺炎，給我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起了國(guó)家有關(guān)部門的高度重視［8－10］。

由于M.bovis不具有細(xì)胞壁，因此β－內(nèi)酰胺類對(duì)其治療無效。此外，由于近年來抗生素的廣泛使用，其持續(xù)的選擇耐藥性壓力使M.bovis逐漸出現(xiàn)了耐藥株，且耐藥率高，范圍廣，呈多重耐藥，其產(chǎn)生耐藥性的直接后果不僅給控制和治療該病帶來困難，而且加劇了抗生素在牛體內(nèi)的殘留，因而，牛支原體的耐藥尤其是多重耐藥問題已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注［11］。

1 M.bovis的耐藥性研究

目前，僅有美國(guó)具有商業(yè)化的疫苗用于預(yù)防牛支原體的感染，而其它國(guó)家均采用抗菌藥物進(jìn)行治療［12］。牛支原體耐藥而導(dǎo)致的臨床抗感染失敗已屢見不鮮，為此，越來越多的臨床工作者積極開展了牛支原體耐藥性檢測(cè)的相關(guān)研究。

1.1 國(guó)外部分地區(qū)對(duì)M.bovis的耐藥性研究 Ayling R D等［12］報(bào)道對(duì)在英國(guó)分離的62株 M.bovis進(jìn)行了耐藥性檢測(cè)，其結(jié)果表明，20%的菌株對(duì)土霉素、壯觀霉素、氟苯尼考耐藥，98%的菌株對(duì)替米考星耐藥，僅部分菌株對(duì)達(dá)氟沙星敏感［12］。Laak E T等［13］對(duì)臨床分離株進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示，所有受試菌株對(duì)泰樂菌素、吉他霉素、硫姆林敏感;對(duì)硝呋喹酸、土霉素、鏈霉素、金霉素中度敏感，對(duì)多西霉素、米諾霉素耐藥。Ricardo F R等［14］對(duì)臨床分離的233株牛支原體進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)并測(cè)定其最低抑菌濃度(MIC)值，結(jié)果顯示，60%菌株對(duì)大觀霉素和氯四環(huán)素耐藥，對(duì)替米考星已高度耐藥，其MIC＞128 μg/mL 的菌株占 60%。Uemura R等［15］報(bào)道，從日本本地牛和澳大利亞進(jìn)口的牛中分離得到88株M.bovis，并采用13種抗微生物藥物對(duì)其進(jìn)行了耐藥性分析，結(jié)果表明，從日本本地牛分離的菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、甲砜霉素、氟甲喹、卡那霉素、林可霉素、氟霉素高度耐藥，對(duì)大觀霉素、氟喹諾酮類敏感，從澳大利亞牛分離的菌株對(duì)紅霉素、甲砜霉素高度耐藥。Marty S等［16］對(duì)在美國(guó)分離的192株牛支原體進(jìn)行了耐藥性檢測(cè)，并用細(xì)胞流式計(jì)數(shù)器對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，所分離菌株對(duì)大觀霉素、頭孢噻呋高度耐藥，對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、四環(huán)素等藥物相對(duì)敏感，其在牛乳中分離的菌株比在肺臟中分離的菌株耐藥程度稍高。

1.2 國(guó)內(nèi)部分地區(qū)對(duì)M.bovis的耐藥性研究 閆鳳英等［17］對(duì)臨床分離的M.bovis進(jìn)行了耐藥性檢測(cè)，結(jié)果表明，大部分菌株對(duì)放線菌素D、絲裂霉素中度敏感，對(duì)紅霉素、鏈霉素、多粘霉素高度耐藥。筆者所在研究室自2010年以來從我國(guó)部分地區(qū)分得4株M.bovis，并對(duì)其進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有菌株均對(duì)氟苯尼考和環(huán)丙沙星呈現(xiàn)相對(duì)耐藥，其MIC為16μg/mL和8μg/mL，對(duì)替米考星相對(duì)敏感，其MIC ≦2μg/mL。

綜上所述，不同國(guó)家和地區(qū)分離的M.bovis，對(duì)常用的各種抗生素均顯示出不同程度的耐藥性，且獸醫(yī)臨床使用頻率較高的抗生素，其產(chǎn)生的耐藥性較高。此外，M.bovis的耐藥性存在著一定的地域差異性，這可能與不同國(guó)家和地區(qū)在動(dòng)物治療中所使用或在飼料中添加的抗生素的種類以及使用方法、對(duì)藥物的用量標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)，從而造成了不同國(guó)家和地區(qū)M.bovis的耐藥性有所差異。

2 支原體的相關(guān)耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀

目前，牛支原體耐藥機(jī)制的研究還很少見，為此，本文對(duì)牛支原體和與他同源關(guān)系較近的肺炎支原體和人型支原體耐藥機(jī)制的研究現(xiàn)狀做以綜述，以期為牛支原體耐藥機(jī)制的研究提供參考。

2.1 M.bovis耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀 相關(guān)研究證明M.bovis對(duì)喹諾酮類抗生素的耐藥機(jī)制與其他微生物類似，其發(fā)生 gyrA、gyrB、parE、parC基因的突變，是介導(dǎo)其產(chǎn)生對(duì)喹諾酮類藥物產(chǎn)生抗性的主要機(jī)制。Shabat M等［17］在對(duì)42株牛支原體進(jìn)行耐藥性檢測(cè)的同時(shí)，也對(duì)其喹諾酮耐藥決定區(qū)的堿基進(jìn)行了測(cè)序分析，其結(jié)果顯示，parC耐藥決定區(qū)第265位發(fā)生了G→A的堿基突變(符合大腸埃希氏菌QRDR區(qū)突變規(guī)律)，并通過SNP－RT－PCR建立了快速檢測(cè)基因突變的方法，既簡(jiǎn)單又快速的檢測(cè)出耐藥株，進(jìn)而降低臨床用藥成本。

2.2 肺炎支原體的耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀 Atsuoka M等［18］在日本的三個(gè)地區(qū)分離到76株肺炎支原體，并篩選到13株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素高度耐藥的菌株(MIC均大于256 μg/mL)，其中，10株菌在核糖體23SrRNA的2063位發(fā)生由A→G的點(diǎn)突變，1株在2063為發(fā)生A→C的點(diǎn)突變，1株在2064位發(fā)生A→G的點(diǎn)突變。Pereyre S等［19］通過在亞抑菌濃度中連續(xù)傳代的方法將肺炎支原體敏感株誘導(dǎo)成為耐藥株，并對(duì)其23SrRNA結(jié)構(gòu)域Ⅴ和Ⅱ進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示，耐藥株23SrRNA結(jié)構(gòu)域Ⅴ中心環(huán)發(fā)生了2611位由C→A的點(diǎn)突變和2062位A→G的點(diǎn)突變，同時(shí)核糖體蛋白L4、L22亦發(fā)生了改變，所有耐藥株的23SrRNA結(jié)構(gòu)域Ⅱ均未發(fā)生堿基突變。在我國(guó)，辛德莉等［20］從臨床分離得到4株對(duì)紅霉素耐藥的肺炎支原體，并首次對(duì)支原體的耐藥機(jī)制進(jìn)行了研究，對(duì)其23SrRNA基因序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，兩株在結(jié)構(gòu)域Ⅴ發(fā)生了2063位A→G的點(diǎn)突變，另外兩株發(fā)生了2064位A→G的的點(diǎn)突變。Yun Y等［21］對(duì)臨床分離耐大環(huán)內(nèi)脂類抗生素的18株肺炎支原體的耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，其耐藥株的23SrRNA不但發(fā)生了2063位A→G和2064位A→G的點(diǎn)突變，還發(fā)生了2617位C→G和2067位A→G的點(diǎn)突變，并進(jìn)一步證明其2063位靶位突變介導(dǎo)了14元大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥，2064位靶位突變介導(dǎo)了14和16元大環(huán)內(nèi)脂類耐藥，2617位靶位突變介導(dǎo)了14和15元大環(huán)內(nèi)脂類耐藥，此外，2067位靶位突變與支原體對(duì)交沙霉素耐藥有關(guān)。

此外，隨著對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機(jī)制研究的深入，外排泵的作用得到了高度的重視，mefA、mefE、mreA等基因編碼的外排泵蛋白能提供對(duì)14元、15元大環(huán)內(nèi)酯類的抗性，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗生素的濃度降低，但支原體是否也存在其類似的機(jī)制，目前還未見相關(guān)報(bào)道［22］。

2.3 人型支原體的耐藥機(jī)制研究現(xiàn)狀 Robertson等［23］在對(duì)人型支原體進(jìn)行耐藥性檢測(cè)的同時(shí)，運(yùn)用斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)其耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，人型支原體存在四環(huán)素抗性決定子(Tetracycline resistance determinant，tetM)，支原體對(duì)四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生抗性，主要是通過tetM基因轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的，tetM廣泛存在于細(xì)菌中，其基因序列位于質(zhì)粒上，可編碼639個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白不但能與核糖體結(jié)合，阻止四環(huán)素附著于30S亞基，還能保護(hù)核糖體，不受四環(huán)素類抗生素的抑制，從而使其對(duì)四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生抗性。但M.bovis對(duì)四環(huán)素的耐藥性是否也與tetM基因有關(guān)，還未見相關(guān)報(bào)道。

此外，與支原體親緣關(guān)系較近的金黃色葡萄球菌對(duì)喹諾酮的耐藥機(jī)制已有闡明，其主要是藥物的主動(dòng)外排系統(tǒng)(efflux system)，其為norA編碼的多肽，含388個(gè)氨基酸，norA引起的喹諾酮類耐藥程度與藥物的親水性強(qiáng)弱有關(guān)［24－25］。

3 問題與展望

目前，作用于核蛋白體的大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素仍是獸醫(yī)臨床治療M.bovis的首選藥，但隨著藥物選擇壓力的持續(xù)促使M.bovis耐藥株逐漸產(chǎn)生，不但使其導(dǎo)致的肺炎、乳房炎的治療成本不斷增加，而且加劇了抗生素在牛體內(nèi)的殘留。經(jīng)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究證實(shí)，肺炎支原體和人型支原體的耐藥機(jī)制主要與藥物靶位的突變和質(zhì)粒攜帶耐藥基因的表達(dá)等因素有關(guān)［26］，是否同樣的機(jī)制也發(fā)生在M.bovis上，尚未見相關(guān)報(bào)道。為此，研究 M.bovis的耐藥性和耐藥機(jī)制，尋求有效的治療方案病并設(shè)法尋求解決M.bovis耐藥的方法，將為促進(jìn)養(yǎng)牛業(yè)健康持續(xù)發(fā)展和保障食品安全奠定基礎(chǔ)。

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