胡亞鵬，郭勝利

(1.陜西眾興高科生物科技有限公司，陜西楊凌712100;2.潤(rùn)盈生物(楊凌)有限公司，陜西楊凌712100)

泰樂菌素是一種畜、禽專用的大環(huán)內(nèi)酯抗生素，其主要成份為泰樂菌素A，取代基不同會(huì)構(gòu)成泰樂菌素B、C、D。其生產(chǎn)過程對(duì)工藝配方的要求較為嚴(yán)格，若配方不當(dāng)可以影響其產(chǎn)生菌及合成前體物質(zhì)各種酶的活性，使構(gòu)成泰樂菌素的各前體濃度發(fā)生變化，從而會(huì)影響合成泰樂菌素的九步反應(yīng)的條件、反應(yīng)速度、轉(zhuǎn)化方向、終產(chǎn)物的數(shù)量[1]。為提高泰樂菌素的產(chǎn)量。本文利用正交試驗(yàn)[2]確定了顯著影響泰樂菌素產(chǎn)量的培養(yǎng)基因素，為泰樂菌素發(fā)酵配方優(yōu)化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 弗氏鏈霉菌(Streptomyces f radiae)，Eli Lilly and Company。

1.1.2 原材料 玉米淀粉，德州福源生物淀粉有限公司;酵母膏，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠;玉米漿，華北制藥康欣有限公司;豆餅粉、玉米蛋白，青島天順宇貿(mào)易有限公司;魚粉，青島昌盛飼料有限公司;豆油，西安邦琪油脂公司;CaCO3、MgSO4·7H2O、NaCl、KNO3、K2HPO4、FeSO4·7H2O。

1.1.3 儀器設(shè)備 LDZX-40CI 75L高壓滅菌器、SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)、LRH-250A生化培養(yǎng)箱、NRBP-207旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)、ScoutⅡ電子天平、OLYMPUS CX-41生物顯微鏡、梅特勒320 pH計(jì)、TU-1800紫外分光光度計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 斜面培養(yǎng):將保藏菌種孢子接入斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)12 d。種子培養(yǎng):將斜面菌種用接種鏟接入50 mL種子培養(yǎng)基/500 mL三角瓶中。在30℃，180 r/min下培養(yǎng)2 d。發(fā)酵培養(yǎng):將種子以10%接種量接入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基/500 mL三角瓶中在30℃，220 r/min下培養(yǎng)7 d。

1.2.2 試驗(yàn)方法

1.2.2.1 通過正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定影響泰樂菌素發(fā)酵產(chǎn)量的顯著培養(yǎng)料因素 影響泰樂菌素產(chǎn)量的因素較多:培養(yǎng)基起始pH值、魚粉、玉米蛋白、K2HPO4和油。本試驗(yàn)結(jié)合公司生產(chǎn)自有配方選取三個(gè)主要發(fā)酵培養(yǎng)料魚粉、玉米蛋白、豆油進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)L9(34)(表1)，其他因素根據(jù)公司生產(chǎn)實(shí)際結(jié)合彭海萍等的試驗(yàn)結(jié)果[3]，確定培養(yǎng)基起始pH為7.20，K2HPO4為0.05%因素水平為不變量，通過直觀分析和方差分析確定發(fā)酵培養(yǎng)料因素的顯著性。

1.2.2.2 化學(xué)效價(jià)的測(cè)定 紫外分光光度計(jì)法測(cè)定化學(xué)效價(jià)，發(fā)酵液加硫酸鋁助濾劑搖勻?yàn)V紙過濾，加0.1 mmol/L鹽酸稀釋，于290 nm處測(cè)定其OD值[4]。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)料正交試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)料正交試驗(yàn)結(jié)果 表2中試驗(yàn)處理數(shù)為9，實(shí)用列4列，其中第4列(D列)為空列，用以估計(jì)誤差模型，數(shù)據(jù)重復(fù)次數(shù)為3。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)料正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 直觀分析 對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見表3。

表3 直觀分析結(jié)果

由表3直觀分析結(jié)果可見各因素作用的主次順序?yàn)镽A＞RB＞RC，即魚粉＞玉米蛋白＞豆油。魚粉和玉米蛋白隨著加量的上升單位有所提高，豆油的變化對(duì)產(chǎn)量影響不大，由圖1可見泰樂菌素發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配比為A3B3C2，即魚粉1.92%，玉米蛋白0.87%，豆油4.8%。

圖1 正交試驗(yàn)效應(yīng)曲線圖

2.3 方差分析 結(jié)果見表4。

表4 對(duì)正交結(jié)果的方差分析

從表4方差分析可以看出，魚粉和玉米蛋白的F比均大于F0.05(2，2)，說明魚粉和玉米蛋白為重要影響因素，對(duì)泰樂菌素發(fā)酵影響達(dá)到了顯著水平。

通過以上正交試驗(yàn)得出，三個(gè)因素中魚粉的影響尤為明顯 F比 =83.025接近于 F0.01(2，2)=99.000，幾乎達(dá)到極顯著水平，突顯了魚粉對(duì)泰樂菌素發(fā)酵的重要性，與彭海萍等[3]以魚粉、豆餅粉、卵磷脂、油等為主要原料，運(yùn)用Plackett-Burmar方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)同樣篩選出魚粉為重要影響因素的結(jié)果一致。

豆油F比＞F0.10(2，2)=9.000說明豆油因素水平的改變對(duì)發(fā)酵亦有一定的影響，這與彭海萍等[3]運(yùn)用Plackett–Burmar分析的結(jié)果基本一致。油的使用在抗生素工業(yè)已有較長(zhǎng)的歷史，只作為一種優(yōu)良的消泡劑而不作為碳源使用。近年來，有以油為碳源提高抗生素產(chǎn)量的研究報(bào)道[5]，與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)泰樂菌素發(fā)酵培養(yǎng)料魚粉、玉米蛋白、豆油進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，通過直觀分析和方差分析得出，魚粉和玉米蛋白的變化對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量具有顯著影響，豆油對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量有一定的影響。魚粉1.92%，玉米蛋白0.87%，豆油4.8%為發(fā)酵最優(yōu)培養(yǎng)基組合，為下一步發(fā)酵罐小試提供了依據(jù)。此優(yōu)化方法簡(jiǎn)單易行，可廣泛用于培養(yǎng)基的篩選優(yōu)化。

[1]郭勝利.一例泰樂菌素生產(chǎn)中配料錯(cuò)誤的補(bǔ)救[J].中國(guó)獸藥雜志，2010，44(2):59-60.

[2]李春喜，王志和，王文林.生物統(tǒng)計(jì)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社，2002.

[3]彭海萍，王 蘭，曹 健，等.培養(yǎng)基成分對(duì)泰樂菌素產(chǎn)量的影響[J].糧食與飼料工業(yè)，2002，4:26-28.

[4]方曉梅，趙志甲，顧?？?泰樂菌素產(chǎn)生菌的空間誘變育種研究[J].航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2005，18(1):121-125.

[5]戚 薇.碳源對(duì)泰樂菌素產(chǎn)量的影響[J].天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，6(1):41-44.