王秀麗，毛開榮，程君生，張立春，丁家波，蔣玉文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌引起的一種危害嚴(yán)重的人畜共患傳染性變態(tài)反應(yīng)疾病[1]，在世界上160多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，給世界養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]，并給世界公共衛(wèi)生造成很大的威脅。其中牛種布魯氏菌病給養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失最大，而威脅人類健康最嚴(yán)重的是羊種布魯氏菌，它可以穿透完整的皮膚對(duì)人造成感染，因此防控羊布魯氏菌病不僅有重要的經(jīng)濟(jì)意義，還具有重大的公共衛(wèi)生意義。目前為止沒有一種診斷羊布氏菌病的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究旨在建立檢測(cè)羊布氏菌病的iELISA方法，為我國(guó)羊布魯氏菌病的檢測(cè)提供新方法。

1 材料與方法

1.1 主要菌種和試劑

1.1.1 菌種 羊種布魯氏菌16M(CVCC 70002)由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏室保存。

1.1.2 試劑 明膠、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體，Sigma公司;脫脂奶粉，B.D.公司;TMB，NUPU公司;試管凝集抗原、虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 血清 陽(yáng)性參照血清、陰性參照血清由本實(shí)驗(yàn)室制備;血清樣本1，共385份，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)和哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，用于臨界值的確定和符合率試驗(yàn);血清樣本2，共1932份，由內(nèi)蒙古動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供，用于臨床試驗(yàn);綿羊小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9、大腸桿菌O157、都柏林沙門氏菌陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備，用于iELISA特異性檢驗(yàn);雞血清、兔血清由本實(shí)驗(yàn)室制備，用于封閉液的篩選。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 將純粹檢驗(yàn)合格的羊種布魯氏菌16M株菌種劃線接種于胰示瓊脂扁瓶，37℃培養(yǎng)48 h后，用適量0.5%石炭酸生理鹽水洗下菌體，80℃滅活2 h;9000 g離心10 min，收集菌體。參照OIE手冊(cè)[3]用熱酚水法提取脂多糖(LPS)抗原。

提取的LPS經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和SAS-PAGE檢測(cè)核酸和蛋白的殘留量，若存在核酸，加入終濃度為15 μg/mL的核酸酶，37℃水浴3 h，若存在蛋白則加入終濃度為15 μg/mL的蛋白酶K，55℃水浴3 h，37℃水浴24 h，收集處理產(chǎn)物，用蒸餾水透析，4000 mL/次，透析3次。

純化的LPS經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和SDS-PAGE鑒定LPS的純度。并用銀氨染色法鑒定LPS。將LPS抗原搖勻，用微量移液器準(zhǔn)確分裝，2 mL/瓶，凍干，稱重，測(cè)定每瓶LPS抗原的質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 iELISA方法的建立

1.2.2.1 抗原包被濃度和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)的確定 抗原用0.01 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)系列稀釋后100 μL/孔包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，用 200 μL/孔 PBST 洗板 4 次，5 min/次;洗板后加入200 μL/孔5%的脫脂奶粉，37℃封閉1 h，用200 μL/孔 PBST洗板4次，5 min/次，然后加入經(jīng)系列稀釋的陰陽(yáng)性對(duì)照血清方陣滴定，37℃孵育1 h，用200 μL/孔PBST洗板4次，5 min/次;按照酶標(biāo)二抗說(shuō)明書加入1∶40000倍稀釋的HRP標(biāo)記兔抗羊IgG 抗 體 100 μL/孔，37 ℃ 孵 育 1 h，用200 μL/孔 PBST 洗板4 次，5 min/次;加入100 μL/孔TMB顯色液室溫下(25℃)避光顯色10 min;按50 μL/孔加入1 mol/L的 H2SO4終止反應(yīng)，測(cè) OD450nm值。

按照上述程序，將抗原和待檢血清分別進(jìn)行系列稀釋(待檢血清起始稀釋倍數(shù)為50，以后2倍系列稀釋至1∶400，抗原起始稀釋倍數(shù)為1∶100，2倍系列稀釋至1∶6400)，后進(jìn)行方陣滴定，確定合適的抗原濃度和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)，根據(jù)抗原的質(zhì)量計(jì)算出抗原的包被濃度。

1.2.2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化 確定最佳抗原包被濃度和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)后，按照控制單一變量法比較0.2%的脫脂乳、2%脫脂乳、10%脫脂乳、0.4%明膠、5%雞血清、5%兔血清的封閉效果，比較封閉37 ℃孵育 90、60、30、20、10 min，4 ℃12 h 的差異;比較待檢血清在 37 ℃ 孵育 90、60、30、20、10 min和4℃過(guò)夜不同孵育時(shí)間的差異;比較HRP標(biāo)記兔抗羊 IgG抗體稀釋1∶10000、1∶20000、1∶40000、1∶80000、1∶160000 倍，在 37℃孵育 90、60、30、20、10 min 的差異;比較顯色液室溫(25 ℃)作用 3、5、8、10、15 min的顯色情況，最終篩選出最佳的反應(yīng)條件，確定該系統(tǒng)的最終反應(yīng)程序。

1.2.2.3 臨界值的確定 將血清樣本1進(jìn)行SAT和RBPT檢測(cè)，將SAT和RBPT均為陽(yáng)性的血清作為陽(yáng)性血清樣本，SAT和RBPT均為陰性的血清作為陰性血清樣本。將所有的樣本用所建立的iELISA進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)結(jié)果計(jì)算陽(yáng)性樣本和陰性樣本的平均值，求S/P值[S/P=(樣本值-陰性均值)/(陽(yáng)性均值 -陰性均值)]。檢測(cè)結(jié)果用MedCalc軟件進(jìn)行ROC曲線分析，取敏感性與特異性之和最高的S/P值為陽(yáng)性和陰性結(jié)果的臨界值。

1.2.2.4 對(duì)照血清的制備 陰性對(duì)照血清的制備將RBPT、SAT、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)檢測(cè)結(jié)果均為布魯氏菌抗體陰性的綿羊血清作為陰性對(duì)照血清，通過(guò)對(duì)大量羊布魯氏菌病陰性血清樣本iELISA檢測(cè)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)，陰性對(duì)照血清iELISA檢測(cè)結(jié)果OD450nm控制在統(tǒng)計(jì)結(jié)果的陰性平均值以下。

陽(yáng)性對(duì)照血清的制備通過(guò)RBPT篩選布魯氏菌病抗體陰性的健康綿羊，用羊種布魯氏菌16M株培養(yǎng)物比濁至10億CFU/mL作為活菌免疫用抗原，羊布魯氏菌16M株培養(yǎng)物80～90℃滅活，比濁至10億CFU/mL作為死菌免疫抗原，按以下程序免疫綿羊:活菌免疫原2 mL腿部皮下注射免疫，21 d，重復(fù)相同的抗原和免疫途徑注射4 mL抗原，28 d后采用同樣注射途徑注射4 mL死菌免疫抗原加強(qiáng)免疫，14 d后采血，通過(guò)SAT檢測(cè)抗體效價(jià)。

人工感染制備的強(qiáng)陽(yáng)性血清用陰性對(duì)照血清做2倍系列稀釋，進(jìn)行 iELISA檢測(cè)，強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照OD450nm值控制在大量陽(yáng)性血清樣本iELISA檢測(cè)結(jié)果的平均值以上，弱陽(yáng)性對(duì)照血清控制在結(jié)果判定的臨界值以上，并且在強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照血清OD450nm值以下。

1.2.3 敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、符合率試驗(yàn)

1.2.3.1 敏感性試驗(yàn) 對(duì)5份臨床陽(yáng)性血清(來(lái)源于血清樣本1)和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照血清、弱陽(yáng)性對(duì)照血清分別用血清稀釋液做2倍系列稀釋，用所建立的iELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)稀釋的血清用虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBPT)和平板凝集試驗(yàn)(SAT)檢測(cè)，記錄判定結(jié)果，比較三種方法的敏感性。

1.2.3.2 特異性試驗(yàn) 對(duì)綿羊布魯氏菌病的陽(yáng)性血清、陰性血清、都柏林沙門氏菌陽(yáng)性血清、大腸桿菌O157陽(yáng)性血清和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9陽(yáng)性血清用建立的iELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證所建立方法的特異性。

1.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)隨機(jī)選擇20110524、20110608、20110611三批包被的酶標(biāo)板各一塊，每塊板均對(duì)上述16份血清進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算三批包被酶標(biāo)板檢測(cè)同一份血清OD450nm的變異系數(shù)，分析批間重復(fù)性效果。選擇20110611批包被的5塊酶標(biāo)板，每塊板均對(duì)16份血清(來(lái)源于血清樣本1)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算同一批包被的不同酶標(biāo)板檢測(cè)同一份血清OD450nm的變異系數(shù)，分析批內(nèi)重復(fù)性效果。

1.2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將包被好的酶標(biāo)板于4℃保存，分別在保存期為2、3、4、7、11 個(gè)月時(shí)對(duì) 16 份血清進(jìn)行檢測(cè)，判定包被好的酶標(biāo)板的穩(wěn)定性。

1.2.3.5 符合率試驗(yàn) 用建立的iELISA及RBPT、SAT對(duì)血清樣本1進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算該iELISA與RBPT、SAT檢測(cè)結(jié)果的符合率。

1.2.4 臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)血清樣本2進(jìn)行iELISA和RBPT檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)iELISA與RBPT檢測(cè)結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 抗原的制備 參照OIE手冊(cè)提取的LPS進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)不到核酸條帶，表明提取物中不含核酸，進(jìn)行SDS-PAGE證明提取物中有蛋白存在，對(duì)此提純抗原加入終濃度為15 μg/mL的蛋白酶K消化，將消化產(chǎn)物透析后，進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果表明，經(jīng)蛋白酶消化處理后的LPS已經(jīng)不含蛋白(圖1)。對(duì)純化的LPS進(jìn)行銀氨染色，結(jié)果表明蛋白酶K消化和透析等處理對(duì)LPS沒有影響(圖2)。最后凍干。凍干后隨機(jī)抽取5瓶稱重，LPS的質(zhì)量為1032 ±3 μg/瓶。

圖1 LPS經(jīng)蛋白酶K消化前后的SDS-PAGE圖

圖2 LPS透析前后的銀染圖

2.2 iELISA方法的建立

2.2.1 抗原最佳包被濃度和待檢血清最佳稀釋度的確定 抗原和待檢血清方陣滴定結(jié)果表明，抗原包被濃度越高，血清稀釋倍數(shù)越低，非特異性反應(yīng)越強(qiáng)，反之則越弱，而陰性血清稀釋倍數(shù)太大將失去意義。最終確定抗原的稀釋倍數(shù)為1∶3200，據(jù)此計(jì)算出LPS抗原的包被濃度為0.16 μg/mL，血清的稀釋倍數(shù)為1∶100。

2.2.2 最佳工作條件的確定 按控制單一變量法對(duì)封閉液、封閉時(shí)間，待檢血清孵育時(shí)間，酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體最佳稀釋度、孵育時(shí)間，顯色時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明0.4%的明膠37℃封閉30 min的封閉效果最佳;待檢血清孵育條件為37℃孵育10 min;酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體最佳工作濃度為1∶40000;最佳孵育條件為37℃，30 min;最佳顯色條件為25℃，10 min。

2.2.3 臨界值的確定 對(duì)血清樣本1中SAT和RBPT檢測(cè)結(jié)果一致(SAT和RBPT同為陽(yáng)性或SAT和RBPT同為陰性)的血清樣本通過(guò)iELISA檢測(cè)，陽(yáng)性血清樣本平均OD450mm為0.83，陰性血清樣本平均OD450mm為0.15，經(jīng)ROC曲線分析，當(dāng) S/P=0.2時(shí)，敏感性為98.41%，特異性為96.65%，見表1，ROC曲線的下面積為(AUC)為0.997，說(shuō)明該診斷方法效果良好(圖3)。

表1 iELISA檢測(cè)羊血清不同的臨界值對(duì)應(yīng)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

圖3 ROC曲線

2.2.4 對(duì)照血清的制備及標(biāo)準(zhǔn)的確定 依據(jù)來(lái)自不同地區(qū)385份血清樣本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，陰性對(duì)照血清控制在陰性樣本統(tǒng)計(jì)結(jié)果的平均值以下(OD450nm≤0.15)，強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照OD450nm的值控制在陽(yáng)性樣本統(tǒng)計(jì)結(jié)果的平均值以上(OD450nm≥0.83)，弱陽(yáng)性血清控制在臨界值以上(0.35≤OD450nm≤0.70)，并以此作為iELISA試驗(yàn)成立的條件。

將人工感染制備的布魯氏菌強(qiáng)陽(yáng)性血清2倍系列稀釋，通過(guò)此iELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照血清OD450nm值為0.15，可選擇此次檢測(cè)的陰性血清;強(qiáng)陽(yáng)性血清(S2)用陰性血清稀釋2倍后OD450nm值為0.931，作強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照血清;強(qiáng)陽(yáng)性血清(S2)用陰性血清稀釋16倍后OD450nm值為0.381，作弱陽(yáng)性對(duì)照血清。

2.3 敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性、符合率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 敏感性試驗(yàn) 將5份陽(yáng)性血清和強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照血清、弱陽(yáng)性對(duì)照血清、分別用血清稀釋液做2倍系列稀釋(2-1～2-12)，用所建立的iELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，當(dāng)血清稀釋到256倍時(shí)全部為陽(yáng)性，有的稀釋到1024倍時(shí)仍能檢測(cè)出來(lái)，強(qiáng)陽(yáng)性參照血清稀釋2048倍時(shí)仍可判定為陽(yáng)性，弱陽(yáng)性血清稀釋128倍時(shí)判為陽(yáng)性。iELISA比RBPT、SAT敏感性高，結(jié)果見表2。

表2 SAT、RBPT、iELISA敏感性比較

2.3.2 特異性試驗(yàn) 對(duì)綿羊布魯氏菌病的陽(yáng)性血清、陰性血清、都柏林沙門氏菌陽(yáng)性血清、大腸桿菌O157陽(yáng)性血清和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9陽(yáng)性血清用建立的iELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示布魯氏菌陽(yáng)性血清和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而布魯氏菌陰性血清、大腸桿菌O157陽(yáng)性血清、都柏林沙門氏菌陽(yáng)性血清iELISA檢測(cè)結(jié)果均為陰性(表3)。

表3 特異性試驗(yàn)結(jié)果比較

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 用20110524批、20110608批、20110611批包被的3批酶標(biāo)板對(duì)上述16份血清檢測(cè)結(jié)果顯示，批間變異系數(shù)在1.1% ～9.8%之間，說(shuō)明批間重復(fù)性良好;用20110611批包被的5塊酶標(biāo)板對(duì)16份血清檢測(cè)結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)在2.9%～9.8%之間，說(shuō)明批內(nèi)重復(fù)性良好。批間重復(fù)性試驗(yàn)和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果符合臨床檢測(cè)要求。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將包被好的酶標(biāo)板于2～8℃保存，分別在保存期為 2、3、4、7、11 個(gè)月時(shí)對(duì)16 份血清檢測(cè)結(jié)果顯示，在11個(gè)月內(nèi)包被酶標(biāo)板檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。

2.3.5 符合率試驗(yàn) 對(duì)來(lái)自泰安、濟(jì)南、哈爾濱的385份血清分別用虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和iELISA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，iELISA與SAT的陽(yáng)性符合率為88.57%，陰性符合率為98.21%;iELISA與RBPT的陽(yáng)性符合率為97.44%，陰性符合率為91.86%;若以SAT和RBPT結(jié)果一致為判定標(biāo)準(zhǔn)，則陽(yáng)性符合率為95.24%，陰性符合率為96.28%;若以SAT或RBPT檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性判為陽(yáng)性血清，SAT或RBPT檢測(cè)結(jié)果陰性判定為陰性血清，則陽(yáng)性符合率為93.63%，陰性符合率為96.62%(表4)。

表4 SAT和RBPT與iELISA的符合率情況

2.4 臨床樣品的檢測(cè) 用本研究所建立的iELISA方法對(duì)血清樣本2進(jìn)行了檢測(cè)，并與RBPT的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較。其中RBPT陽(yáng)性血清161份，iELISA檢出157份，與RBPT的陽(yáng)性符合率為97.5%，RBPT陰性血清1771份，iELISA檢出1614份，陰性符合率為91.1%，總符合率為91.7%。

3 討論與小結(jié)

研究以純化的布魯氏菌LPS為包被抗原，建立了檢測(cè)羊布魯氏菌病的iELISA方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法抗原用量低，包被濃度僅為0.16 μg/mL，降低了檢測(cè)成本;對(duì)大量臨床樣品的檢測(cè)以及與RBPT、SAT檢測(cè)結(jié)果比較，iELISA具有較高的敏感性;特異性試驗(yàn)證明該方法可以有效排除布魯氏菌與大腸桿菌O157和都柏林沙門氏菌的交叉感染，特異性良好;符合率試驗(yàn)證明iELISA與SAT和RBPT的符合率大于90%;批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10%，表明該檢測(cè)方法具有良好的可重復(fù)性;保存期試驗(yàn)證明在1年之內(nèi)，包被酶標(biāo)板的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定;經(jīng)過(guò)不同條件的優(yōu)化，該檢測(cè)的整個(gè)過(guò)程只需要1 h，一次可檢測(cè)大量的臨床樣品，比以往的iELISA檢測(cè)方法更加省時(shí)。

iELISA的符合率試驗(yàn)顯示，RBPT、SAT、iELISA檢測(cè)結(jié)果有時(shí)不完全一致，這與布魯氏菌感染后不同時(shí)期產(chǎn)生抗體類型的差異有關(guān)，布魯氏菌感染初期誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體主要是IgA和IgM，凝集反應(yīng)很強(qiáng)，而本研究所建立的iELISA檢測(cè)抗體為IgG。布魯氏菌的分離鑒定雖然是布魯氏菌病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是布魯氏菌的分離效率比較低，感染的大部分時(shí)期分離不到菌體，所以確診布魯氏菌病的方法有待進(jìn)一步研究。

由于該檢測(cè)方法選擇的抗原是光滑型布魯氏菌的LPS，粗糙型抗體與之不發(fā)生反應(yīng)，且特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示iELISA不能有效區(qū)分小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O9與布魯氏菌的LPS-IgG抗體，為解決以上問(wèn)題，選擇一種能引起較強(qiáng)體液免疫反應(yīng)的布魯氏菌共同蛋白作為抗原建立方法是將來(lái)研究的重要方向。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，OMP28蛋白的抗原性良好[4-6]，但與其他的檢測(cè)方法一樣，該方法不能區(qū)分野毒感染和布魯氏菌疫苗免疫產(chǎn)生的抗體，解決該問(wèn)題寄希望于基因缺失疫苗株的構(gòu)建以及相應(yīng)的亞單位疫苗的研究。

目前用于布魯氏菌病的診斷方法主要有(RBPT，SAT等傳統(tǒng)血清學(xué)診斷方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR 技術(shù)[7-9]、核酸探針技術(shù)[10]等應(yīng)用于布魯氏菌抗原的診斷。ELISA[11-12]、熒光偏振技術(shù)[13]、免疫酶組化技術(shù)[14]、膠體金標(biāo)記[15-16]等免疫學(xué)技術(shù)應(yīng)用于布魯氏菌病抗體檢測(cè)的研究日益增多。但這些檢測(cè)方法或者接觸活菌，存在生物安全隱患;或者靈敏度低，存在漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，不利于布魯氏菌病的凈化;或者需要特定的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員，難以在基層推廣應(yīng)用。本研究建立的iELISA方法操作方便，靈敏度和特異性均較高，省時(shí)省力，對(duì)檢驗(yàn)人員專業(yè)素質(zhì)的要求不高，方便在臨床推廣應(yīng)用，具有良好的應(yīng)用前景。

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