梁廣勝，殷明，劉玉亮，何丁文

椎間盤是脊柱椎體間的主要連接組織，極富有彈性，可以均衡椎體間相互作用的生物力和緩沖外界壓力，對人體的運動、穩(wěn)定、平衡等有著重要的生物學意義。

目前，椎間盤退行性病變的患病率明顯增加，且呈年輕化趨勢。椎間盤退變是一種與年齡相關的疾病，引起退變的因素眾多，其共同特點是髓核細胞(NPC)數(shù)量減少和功能減退、細胞外基質含量明顯下降且比例失調。這些都是椎間盤細胞衰老或凋亡的表現(xiàn)。椎間盤細胞的衰老和凋亡是其組織退變過程中一個非常關鍵的因素[1]。對椎間盤退變的機理研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤退行性病變是從纖維環(huán)中央的髓核細胞衰老開始，并進行程序性退變的過程[2]。

成年人的髓核細胞壽命很短，自我更新能力有限。伴隨著髓核細胞分裂次數(shù)增加，端粒長度不斷減少；當端粒縮短到一定的程度，即所謂末端限制片段(TRF)的長度為5～7 kb時，細胞進入危機期M1(crisis M1)，從而觸發(fā)某種信號，使其在細胞周期的檢查點(check point)處受阻，致使髓核細胞退出細胞周期，最終導致細胞周期停滯或細胞衰老。

研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶(telomerase)對椎間盤細胞的生命周期和活性具有調節(jié)作用[3]。因此從端粒酶調節(jié)椎間盤細胞的角度研究和探討其對延緩椎間盤退變的機理，對重建結構、恢復功能具有十分重要的意義。

1 端粒酶結構和功能

端粒酶是一個具有逆轉錄酶功能的核糖核蛋白(ribosenuclearprotein,RNP)復合酶，包含端粒酶RNA(the telomerase RNA,TR)、端粒酶催化蛋白亞基(catalytic protein subunit or telomerase reverse transcriptase,TERT)和相關性輔助蛋白(telomerase accessory protein)[4]。TR核酸序列的數(shù)量、排列順序和方式與物種相關。人類TR(hTR)成分于1995年首次克隆成功，并證實hTR有451個核苷酸組成。TR序列和長度都有保守的二級結構和相對穩(wěn)定的三級結構。Cohen等用色譜法測定人端粒酶復合物的分子質量是650 kDa～670 kDa，并測定其為TERT(127 kDa)、TR(153 kDa)和 dyskerin(57 kDa)組成的二聚體[5]。

TR是端粒酶結構的催化核心不可或缺的部分之一，并提供端粒延長所需的重復序列的模板，這個非編碼RNA包含的基元與端粒酶活性重組有著密切聯(lián)系。

端粒酶輔助蛋白成分大約分為端粒酶RNP相關蛋白、TERT相關蛋白及TR相關蛋白。這些蛋白對端粒酶的組裝、定位、激活和核糖核苷酸生物合成以及維持端粒酶的穩(wěn)定性，都起著重要的作用。

TERT又稱端粒酶逆轉錄酶，起源于反轉錄轉座子，并在其他輔助酶作用下發(fā)揮作用——利用RNA合成DNA。HTERT是人類端粒酶催化活性組件的核心成分，是端粒酶發(fā)揮生物學作用的功能中心，也是端粒酶激活的限速酶。hTERT在眾多水平上發(fā)揮作用，包括基因的表達、剪切，蛋白質的折疊、翻譯后修飾，嚴格控制和管理端粒酶的活性等。HTERT與端粒DNA特異性識別并結合，通過合成重復序列(5'-GGT TAG-3')并連接到端粒的末端來維持染色體在復制過程中動態(tài)平衡、穩(wěn)定染色體結構和促進細胞增殖和生長，進而參與人體細胞的衰老和凋亡的調節(jié)[6]。

椎間盤細胞的增殖和生長也受到端粒酶活性調節(jié)。研究顯示，在退變的椎間盤細胞內，端粒酶的活性受到抑制或破壞，不能有效維持染色體平衡，導致端粒在復制過程中持續(xù)性縮短，促進細胞的老化和加快椎間盤退變的進程[7-8]。Kim等對椎間盤細胞衰老的機制和信號傳導通路進行研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性和端粒的長度隨椎間盤退變的程度加重而降低或縮短，同時還發(fā)現(xiàn)端粒酶活性降低能促進椎間盤組織內的衰老細胞的積累[9]。以上研究表明，端粒酶的生物學功能與椎間盤發(fā)生退行性病變有著十分密切的關系。

Geserick等發(fā)現(xiàn)，缺乏端粒酶的小鼠會提前衰老，并且器官和組織(包括椎間盤)的功能明顯降低；當小鼠重新重新獲得具有活性的端粒酶后，其組織重新修復，功能恢復到實驗前的水平，細胞老化也發(fā)生逆轉[10]。Jaskelioff等研究也證實了端粒酶可以逆轉端粒酶缺失導致的組織變性，治療與年齡相關的疾病如椎間盤退變[11]。這些為端粒酶治療椎間盤退變提供了一定的理論基礎和前提。

2 端粒酶延緩椎間盤退變的細胞機制

端粒酶負責維持端粒動態(tài)平衡。端粒酶介導的TTAGGG重復序列合成可以彌補染色體在復制過程中的丟失和損壞，以維持端粒長度的平衡、維持基因完整性和染色體穩(wěn)定性，進而影響細胞生長、轉化、自我更新和增殖，對延長細胞壽命具有重要意義，甚至可能誘導細胞逃脫程序性死亡，獲得無極限的增殖能力，即永生化。

端粒酶能從細胞維護和保養(yǎng)方面延緩椎間盤退行性病變。Liang等用端粒酶基因轉染髓核細胞，產生一個永久性的椎間盤細胞系：被轉染的髓核細胞后代生長速度明顯增快；將這種細胞和正常的髓核細胞放在一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)正常髓核細胞的壽命也明顯延長[12]。Chung等用非病毒脂質體介導端粒酶基因轉染髓核細胞發(fā)現(xiàn)，端粒酶能增強髓核細胞的分裂能力，延長髓核細胞壽命至496 d，髓核細胞基質在282 d內持續(xù)表達，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的合成量大約是對照組的46倍和32倍，直至細胞衰老[13]。實驗表明端粒酶除了能延長細胞壽命外，還能促進細胞基質的合成與分泌。Wu等通過端粒酶基因轉染髓核細胞，髓核細胞中衰老細胞的百分比為30%～3%(端粒酶基因轉染后)和64%～4%(對照組)；同時還發(fā)現(xiàn)細胞外基質產物，如膠原蛋白在120 d內明顯增加，第21天最明顯，產量是對照組的7.2倍[14]。Niu等通過端粒酶活性很高的骨髓間充質干細胞(MSC)和正常的髓核細胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)髓核細胞合成的細胞外基質，如蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白含量明顯增多，髓核細胞生長速率加快[15]。hTERT基因轉染髓核細胞相比正常髓核細胞，壽命明顯延長，增殖速度加快[12]。

端粒酶除了能促進細胞的增殖、分泌和延長壽命以外，還有其他的生物作用。Ruan等通過用端粒酶陽性的Wharton's jelly cells(WJCs)定向培養(yǎng)和誘導髓核細胞分化，成功地發(fā)現(xiàn)有新的髓核細胞生成[16]，表明端粒酶對髓核細胞的分化起著重要的作用。Sharma等發(fā)現(xiàn)，端粒酶具有增加染色體組型的穩(wěn)定性和增強DNA損傷修復的能力[17]。端粒酶還具有抗轉化生長因子β的表達、促進生長因子的合成、抑制金屬蛋白細胞酶、抑制細胞凋亡的信號通路、誘導過氧化氫介導的損傷等多種生物學功能。這些功能對椎間盤組織修復和延緩退行性病變有重要意義。

Bodnar等將TERT基因轉染到端粒酶陰性的細胞，發(fā)現(xiàn)端粒酶可以延長細胞的壽命，維持細胞的正常核型和細胞表型的年輕態(tài)，不會發(fā)生細胞惡性轉化[18]。被轉染的髓核細胞后代表現(xiàn)出生長速度快，并成功傳代20代以上；轉染后髓核細胞無惡變，而是保持典型的原代細胞形態(tài)特征和染色體穩(wěn)定的表征[12]。在正常的干細胞、生殖細胞和新生組織內，端粒酶活性很高。這提示端粒酶不具有致癌性。

3 端粒酶延緩椎間盤退變的信號通路

從細胞學角度分析，椎間盤退行性病變是由于椎間盤細胞發(fā)生了衰老或凋亡，具有活性的細胞數(shù)目減少。細胞的老化是在應對外界各種生物力的條件下，程序性地發(fā)生細胞的生理功能下降和紊亂。目前椎間盤發(fā)生退行性病變的具體機制還不清楚。而了解并控制椎間盤細胞生長和分化的信號通路有助于椎間盤潛在的治療。

Tabach等通過研究椎間盤細胞功能和端粒酶以及p53活性誘導其下游的168個基因表達的關系發(fā)現(xiàn)，在細胞G1/S期，hTERT的表達比較密集，能上調p53基因的活性，原癌基因誘導的衰老(oncogene-induced senescence,OIS)明顯受到抑制；在衰老的椎間盤組織中，細胞hTERT活性降低，未能抑制p53基因的活性，導致p53大量表達；同時發(fā)現(xiàn)，在p16基因沉默狀態(tài)下，細胞周期明顯縮短，OIS被激活，細胞衰老相關基因表達處于相當高的水平；將抑制p53和p16的抑制物導入椎間盤組織中，喪失自我更新能力的細胞功能又得到恢復[19]。推測端粒酶延緩椎間盤退變的機制與其調節(jié)p53-p21-pRb途徑和p16-pRb途徑有緊密聯(lián)系。最近幾年有研究發(fā)現(xiàn)，其機制還與Wnt/β-catenin途徑有關。

3.1 p53-p21-pRb通路

伴隨椎間盤細胞的分裂和增殖，其細胞DNA末端的端粒發(fā)生進行性縮短。當椎間盤細胞端粒長度到達某一臨界值(Hayflick limit)時，DNA發(fā)生損傷反應，端粒的功能也發(fā)生明顯障礙，從而觸發(fā)DNA損傷應激反應(DNA damage response，DDR)，這與磷酸化形式的H2AX組蛋白變體(G-H2AX)和DDR蛋白53BP1、NBS1、MDC1有關，同時DDR相關激酶ATM和ATR也被激活，進而引起細胞的衰老和凋亡[20]。而端粒酶通過修復端粒長度和上調抑癌基因p53的轉錄活性，以及降低依賴p53的細胞應激反應，繼而通過p53-p21-pRb通路提高椎間盤細胞對p53導致衰老的抵抗力。

p53基因是一種腫瘤抑制蛋白的轉錄調控基因，通過細胞周期蛋白(cyclins)－細胞周期蛋白依賴蛋白激酶(CDKs)－細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白(CKIs)的網絡來完成對細胞周期G1/S期和G2/M期的調控。p53能通過調節(jié)其轉錄激活區(qū)和序列特異性DNA結合區(qū)誘導其下游眾多基因的轉錄表達。而p53在端粒酶活性較高水平的情況下，表達水平會明顯降低，導致被p53轉錄激活的p21WAF1/cip1(CDK激活酶的抑制因子)也明顯減少，導致其與cyclinD-CDK4/6和cyclinE-CDK2復合物結合的能力下降，上調它們的激酶活性，促其磷酸化pRb。Rb蛋白在磷酸化狀態(tài)下，與轉錄因子E2Fs結合明顯下調，使其釋放具有轉錄因子活性的E2Fs。從而使E2F與其靶基因結合增強，靶基因表達增強后，椎間盤細胞進入S期，最終導致處于G1/S期的細胞數(shù)目明顯增多。

G1/S期是細胞周期中的3個關卡(check point)，即G1/S期、G2/M期以及紡錘體裝配關卡中最重要的一個關卡。它也是細胞周期中的一個限速步驟[21]。Kim等通過對人類椎間盤退變的機制研究證實，在所有衰老髓核細胞中，端粒酶的活性明顯受到抑制或破壞，其調節(jié)的p53、p21和pRb表達同時呈強陽性[9]。Liang等進一步證實，將端粒酶基因轉入的髓核細胞內，端粒酶的活性明顯增強，其調節(jié)的p53表達水平降低，p53-p21-pRb通路受到抑制，能延緩髓核細胞的衰老過程和椎間盤退行性病變進程[12]。

3.2 p16Ink41-pRb通路

p16基因又叫多腫瘤抑制(multiple tumor suppressor,MTS)基因，是迄今為止得到公認的抑癌基因，也是一種直接調節(jié)細胞周期的基因。它能負向調節(jié)椎間盤細胞自我更新能力。Beach等證明，P16蛋白是CDK4和CDK6抑制因子的關鍵酶之一，P16通過取代細胞周期蛋白cyclinD與CDK4和CDK6結合，使細胞周期中cyclinD-CDK4/6和cyclinE-CDK2蛋白復合物的活性受到降低或抑制，使pRb處于去磷酸化或低磷酸化狀態(tài)而減少轉錄因子E2Fs釋放，從而阻止DNA的生物合成，促使細胞停滯在G1/S期，進一步阻礙細胞的有絲分裂。這就是經典的p16Ink41-pRb通路。研究發(fā)現(xiàn)，在端粒酶活性處于高水平時，椎間盤組織內的細胞p16Ink41-pRb途徑的表達明顯受到抑制[22]。Park等證實，老化的髓核細胞中，端粒酶的活性受到抑制或破壞，而這些衰老細胞的p16Ink41表達均呈免疫強陽性；通過誘導p16Ink41-pRb通路的激活，能加速髓核細胞的衰老和凋亡，進而能推動椎間盤發(fā)生退行性病變的進程[23]。表明端粒酶調節(jié)p16Ink41-pRb通路與延緩椎間盤退變的過程也有著密切聯(lián)系。但是兩者之間的關系還需進一步研究。

3.3 Wnt/β-catenin通路

端粒酶是Wnt/β-catenin通路的轉錄復合物的輔助因子，與BRG1(一個SWI/SNF相關的染色質重塑蛋白)相互作用，激活TOP-FLASH受體來驅動其他β-catenin的靶基因，包括cyclinD1、c-myc和siamois來調節(jié)細胞的增殖，并通過抑制Wnt/β-catenin的信號進而調節(jié)WNT蛋白以及相關保護性蛋白的合成和分泌來維護椎間盤細胞的活性[24-25]。TERT可以通過Wnt/βcatenin通路調節(jié)椎間盤細胞內的代謝因子以及分解因子的合成和分泌，并使其處于動態(tài)平衡中，也能通過調節(jié)細胞周期來增強細胞的自我更新能力[26]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路與椎間盤細胞內環(huán)境穩(wěn)定以及細胞的老化有著密切的聯(lián)系。Yuasa等發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路在椎間盤退變發(fā)病機制中起著十分重要的作用[27]。Hiyama等發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路在維持椎間盤細胞外基質內穩(wěn)定中起著重要的作用[28]。激活椎間盤細胞Wnt/β-catenin信號通路后，細胞增殖率明顯降低，細胞周期停滯在G2/M期，從而加速椎間盤退行性病變的進程。

Wnt/β-catenin信號分子的受體是卷曲蛋白(Frizzled)，而其輔助受體是低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(RP5/6)。β-catenin蛋白是Wnt/β-catenin信號途徑的下游樞紐信號因子。當胞外存在Wnt信號通路特異性抑制物端粒酶時，WNT蛋白與其受體的結合受到抑制，進而促進下游蛋白質降解復合物合成，包括結腸腺瘤樣息肉(APC)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、軸蛋白(axin)和酪蛋白激酶1(casein kinase 1,CK1)。細胞質中的axin/GSK-3/APC/CK1復合體與β-catenin結合后，促進細胞內信號分子β-catenin的降解。與此同時，該降解物上的GSK-3β能將磷酸基團加到β-catenin氨基端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上使βcatenin發(fā)生磷酸化；磷酸化后的β-catenin通過泛素化途徑被蛋白酶體降解，最終導致細胞內的β-catenin總體水平明顯降低。而β-catenin能進入細胞核與T細胞因子(TCF/LEF)、DNA結合形成三元復合物，改變DNA的結構，并結合轉錄活化因子P300/CBP家族、myc基因家族以及cyclinD1、c-myc與siamois等，啟動靶基因的表達，使細胞無法進入M期，而停滯于G2/M期。TERT下調β-catenin表達水平，使其進入細胞核的數(shù)量減少，降低β-catenin對椎間盤細胞周期的負向調節(jié)。TERT還能調節(jié)WNT3A配體，有效誘導axin2的合成，進而調節(jié)細胞有絲分裂的G1/S期，并且在一定條件下可以促進Wnt通路的自我更新、增殖或生存[25]。Wnt/β-catenin信號通路是一種在進化上高度保守的信號通路，參與細胞生長、增殖、分化、凋亡等廣泛的生物學過程。這些功能對減緩椎間盤退變有生物學意義。

4 討論及展望

通過探討端粒酶對椎間盤細胞生物學功能以及相關信號通路的影響，我們發(fā)現(xiàn)，端粒酶對椎間盤細胞調控是一個多因子參與、多水平調節(jié)的過程，涉及到細胞整體功能水平、基因水平、信號通路的分子水平等。端粒酶不僅能通過p53-p21-pRb通路、p16Ink41-pRb通路和Wnt/β-catenin信號通路調節(jié)椎間盤細胞的自我更新，還能促進椎間盤細胞延長壽命、增殖、分泌和維持基因遺傳穩(wěn)定性、DNA修復等眾多功能。目前，端粒酶延緩椎間盤退變的研究主要集中在如何減緩或逆轉椎間盤組織退變以及具體的機制方面，實驗研究顯示端粒酶能夠促進髓核細胞分泌蛋白多糖、Ⅱ型膠原等細胞基質，恢復退變的人髓核細胞的活性，刺激相關基因的表達，并對退變早期的椎間盤尤其是髓核組織具有修復功能，是轉基因療法治療椎間盤疾病比較理想的目的基因。

實驗證實外源性TERT基因可有效誘導端粒酶的合成和調節(jié)端粒酶的活性，有助于椎間盤細胞在有絲分裂過程中維持端粒長度的動態(tài)平衡，保持染色體的穩(wěn)定性和完整性，從而延緩椎間盤組織的退變。

雖然在體外實驗中，端粒酶基因治療椎間盤退變的研究得到良好的效果，但在臨床中仍然存在著許多需要解決的問題：①目的基因的表達時間短，在臨床中應用有一定的局限；②椎間盤病變的相關基因仍不明確，外源性基因轉入、表達的有效性及其調控機制仍不完善；③多數(shù)椎間盤退行性病變動物模型是通過人為因素如物理或化學損傷實現(xiàn)，這與自然發(fā)生的人椎間盤退行性變的生物學改變有一定區(qū)別。

迄今為止，人類已經成功利用端粒酶基因治療與年齡相關性的疾病，如心血管疾病和白血病。隨著分子生物學技術的發(fā)展和各項試驗研究的開展、深入、完善，端粒酶用于臨床預防和治療椎間盤突變必將有廣闊前景。

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