劉慧娜，王瑋

（1.鄭州市骨科醫(yī)院，鄭州 450052；2.河南大學藥學院，河南開封 475001）

堿性成纖維生長因子納米粒的制備及體外釋放研究

劉慧娜1＊，王瑋2

（1.鄭州市骨科醫(yī)院，鄭州 450052；2.河南大學藥學院，河南開封 475001）

目的：制備堿性成纖維生長因子（bFGF）納米粒（NP），并考察其體外釋放特性。方法：以生物可降解材料α-氰基丙烯酸正丁酯（PBCA）為載體，采用乳化聚合法制備bFGF-PBCA-NP，并以粒徑和包封率為指標，采用正交試驗優(yōu)選α-PBCA（μl）與bFGF（μg）的比例、泊洛沙姆F68的質量分數(shù)和加入bFGF后溶液的pH值；采用電子透射顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)，考察bFGF-PBCA-NP的粒徑及其分布、包封率、載藥量和72h的體外累積釋藥量（Q），并進行一級動力學、Higuchi、Weibull、雙指數(shù)雙相動力學及多項式方程擬合。結果：α-PBCA與bFGF的比例為4.8，泊洛沙姆F68為3%，pH為2.0；所得納米粒為圓整的類球形實體粒子，平均粒徑為（120.5±1.60）nm，載藥量為（4.26±0.02）%，包封率為（89.35±0.83）%；bFGF-PBCA-NP的體外釋放以雙指數(shù)雙相動力學和多項式方程擬合較好，r分別為0.9905和0.9947。結論：所制備的bFGF-PBCA-NP具有明顯的緩釋作用。

堿性成纖維生長因子；α-氰基丙烯酸正丁酯；納米粒；制備；正交試驗；體外釋放

冠心病是目前導致人類死亡的主要疾病之一，在我國其發(fā)病率呈逐年增高趨勢，越來越多醫(yī)學工作者在不斷尋求新的冠心病治療方法。治療性血管生成（Therapeutic angiogenesis）或稱“生物搭橋”（Biologic bypass）的方法是目前冠心病治療研究的熱點。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)血管新生過程中，有許多細胞因子的參與，而堿性成纖維生長因子（bFGF）就是其中之一[1]。bFGF具有促進缺血心肌新生血管形成和保護心肌細胞的作用，是“藥物冠脈搭橋”的重要組成部分，適用于冠心病及周圍血管病的治療，其潛在的治療價值已得到心血管界的重視[2]。但是bFGF在體內的半衰期為3～10min，全身應用將被快速滅活而難以發(fā)揮其有效作用；在溶液中的穩(wěn)定性較差，局部穿刺分次給藥也難以產生有效作用，并且不適合長期給藥。因此研究bFGF的納米粒對長期維持局部藥物的有效濃度、促進新生血管生長有著重要意義。

1 材料

bFGF試劑盒（上海麥莎生物有限公司分裝）；Bio-tek-Model酶標分析儀（美國Bio-tek Instruments.INC公司）；CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司）；YP-600型電子天平（上海第二天平儀器廠）；AB135-S電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；JEM-100CX-Ⅱ電子透射顯微鏡（日本電子公司）。

α-氰基丙烯酸正丁酯（α-PBCA，廣州白云醫(yī)用膠股份有限公司）；bFGF凍干粉末（暨南大學生物研究中心，純度：＞95%）；三羥甲基氨基甲烷（上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠）；其他試劑均為市售分析純產品；所用水皆為SZ-93自動雙重純水制備系統(tǒng)制備。

2 bFGF-PBCA微球（NP）的制備

2.1 乳化聚合法制備[3-4]

制備bFGF-PBCA-NP。精密量取5ml含有一定濃度泊洛沙姆F68、pH 7.6的三羥甲基氨基甲烷（Tris）緩沖水溶液，然后加入適量bFGF的超純水溶液，置于恒溫加熱磁力攪拌器上，660r/min持續(xù)攪拌下，用0.1mol/L HCl將pH調至2.0，以微量注射器精密量取α-PBCA適量并加入高速攪拌的溶液中，1h后，用0.05mol/L HCl調節(jié)pH至中性，繼續(xù)攪拌1h即得bFGF-PBCA-NP膠體溶液。同法制備不含bFGF的空白納米粒。

2.2 正交試驗優(yōu)化制備工藝

根據(jù)相關文獻和預試驗確定單因素，通過對制備條件溫度、攪拌速度、攪拌時間、加入bFGF后溶液的pH值、bFGF用量和泊洛沙姆F68濃度進行考察，并以載藥納米粒的粒徑、包封率（EE）和載藥量（DL）為指標，優(yōu)選出影響bFGF-PBCA-NP制備的主要因素有3個：α-PBCA（μl）與bFGF（μg）比例（A）、泊洛沙姆F68質量分數(shù)（B）、加入bFGF后溶液的pH值（C）。根據(jù)指標納米粒的粒徑、包封率和載藥量的權重，分別給3個指標0.2、0.5、0.3的權重系數(shù)，采用綜合加權評分法[5-6]，綜合評分＝粒徑min/粒徑×100×0.2+EE/EEmax×100×0.5+DL/DLmax×100×0.3。每個因素選擇3個水平，按正交試驗表L9（33）進行試驗[3]。正交試驗因素與水平見表1，結果分析見表2、表3。

表1 因素與水平Tab1 Factor and levels

表2 正交試驗結果Tab2 Results of orthogonal design

表3 正交試驗結果分析Tab3 Analysis of the results of orthogonal design

R值大小可以看出不同因素對試驗結果影響的程度。R值越大，說明此因素對所考察指標的影響越大。由表3中的結果可得，α-PBCA與bFGF比例對DL和EE的影響較大，而粒徑受pH值影響較大。

比較K值大小可了解該因素的不同水平對試驗結果的影響的程度。對DL和EE而言，K值越大的水平越理想；而對粒徑而言，K值越小的水平越理想。采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對正交試驗進行數(shù)據(jù)處理，結果表明，α-PBCA與bFGF比例對EE有顯著影響（P＜0.05），而泊洛沙姆F68質量分數(shù)和pH值對DL和EE無顯著影響（P＞0.05）；pH值對bFGF-PBCA-NP的粒徑有顯著影響（P＜0.05），α-PBCA與bFGF比例和泊洛沙姆F68質量分數(shù)對粒徑無顯著影響（P＞0.05）。

綜合表2和表3的結果，確定最佳處方和工藝為：A2B3C1，即α-PBCA與bFGF比例為4.8，加入酸后調節(jié)加入bFGF后溶液的pH值為2.0，泊洛沙姆F68質量分數(shù)為3%。

3 納米粒的形態(tài)學及粒徑考察

3.1 納米粒的形態(tài)考察

透射電子顯微鏡照片見圖1，粒徑分布見圖2。

圖1 bFGF-PBCA-NP電鏡照片（×20000）Fig1 TEM micrograph of bFGF-PBCA-NP（×20000）

圖2 bFGF-PBCA-NP粒徑分布圖Fig2 Particle size and distribution of bFGF-PBCA-NP

結果，制得納米粒為圓球形或類球形，大小較均勻，不粘連，分散良好，粒徑分布較窄，且基本呈正態(tài)分布，平均粒徑為（120.5±1.60）nm。

由圖2可見，制得的納米粒為規(guī)則的圓球形，表面較光滑。D10＝72.5nm，D50＝119.15nm，D90＝164.5nm。根據(jù)跨距的計算方法可得跨距為0.77，表明其粒徑分布較窄，大小較均勻。

3.2 DL、EE的測定

采用離心法[3]，取制得納米粒的膠體溶液適量，置于專用塑料離心管中，配對后放入高速冷凍離心機中離心。運行參數(shù)為：轉速15000r/min，溫度設定為4℃。離心2h后，取離心后的上清液適量，采用酶聯(lián)免疫法[7]分別測定m1和m2，按照公式計算DL和EE。

式中，m1為加入的藥物總質量（mg）；m2為上清液中藥物質量（mg）；m0為制得的納米粒的質量（mg）。

結果，批號為071002、071004、071005的3批bFGF-PBCA-NP的DL與EE分別為4.26%、90.3%，4.24%、89.9%，4.28%、90.7%，平均值分別為（4.26±0.02）%、（89.35±0.83）%。

4 bFGF-PBCA-NP的體外釋藥

4.1 釋放介質的選擇

在研究微粒制劑體外釋放時，為模擬體內條件，常選擇生理鹽水或磷酸鹽緩沖液作為釋放介質。在本研究中，選擇磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）作為釋放介質。

4.2 藥物測定方法

bFGF的測定方法采用酶聯(lián)免疫法，依照次序分別精密吸取不同質量濃度的bFGF標準品溶液各100μl，標準品質量濃度分別為0、50、100、250、500、1000pg/ml，記錄光密度（OD）結果。以結合率B/B0（%）（B＝標準品OD值，B0＝標準品0點OD值）對bFGF質量濃度（c）進行直線回歸，并繪制標準曲線，得回歸方程為B/B0（%）＝－0.082c+93.316（r＝0.9929），線性范圍為0～1000pg/ml。

4.3 bFGF在釋放介質中的穩(wěn)定性考察

將配成一定質量濃度的bFGF水溶液置于三角瓶中，放入恒溫振蕩箱中，保持37℃，分別于不同時間取出0.4ml，并補加等體積釋放介質。將樣品按照酶聯(lián)免疫試劑盒操作方法將樣品進行處理后，在酶標分析儀上測定樣品在0、1、4、8、12、24、36、48、72h的OD值，并計算質量濃度c（pg/ml）。結果c僅下降8.84%，表明樣品在72h內穩(wěn)定，RSD＜2.0%。

4.4 樣品體外釋放[8-9]

將所制得的納米粒膠體溶液補加釋放介質至40ml，置于磨口三角錐形瓶中，其中bFGF的理論質量濃度約為120ng/ml。將錐形瓶浸入37℃恒溫振蕩器中，維持37℃恒溫振蕩，于不同時間取樣0.4ml，然后補加相同體積的釋放介質。在酶標分析儀上測定樣品中bFGF的OD值，并計算累積釋放量（Q），繪制累積釋放曲線。結果，0、1、2、4、8、12、24、36、72h的Q分別為（0.43±0.50）%、（7.15±0.68）%、（15.65±0.73）%、（21.09±0.71）%、（26.99±0.82）%、（36.71±1.04）%、（4.64±0.94）%、（66.86±1.08）%、（73.92±0.89）%，累積釋放曲線見圖3。

圖372 h內bFGF-PBCA-NP累積釋放曲線Fig3 The accumulative release curves of bFGF-PBCA-NP within 72h

4.5 體外釋藥曲線擬合

以Q對時間（t）分別采用一級動力學（Ⅰ）、Higuchi（Ⅱ）、Weibull（Ⅲ）、雙指數(shù)雙相動力學（Ⅳ）及多項式方程（Ⅴ）對釋藥數(shù)據(jù)進行擬合，結果見表4[AIC＝nlnRe+2P，n為試驗數(shù)據(jù)的個數(shù)，P為所設模型參數(shù)的個數(shù)，Re＝∑Wi（Q擬合－Q）2，Wi為權重]。

表4 不同擬合方程bFGF-PBCA-NP的擬合結果Tab4 Comparison of in vitro accumulative release data of bFGF-PBCA-NPfitted by different equations

結果可見，bFGF-PBCA-NP體外釋放曲線一級動力學、Higuchi和Weibull方程擬合均不佳，而雙指數(shù)雙相動力學和多項式方程擬合后效果較好，表明bFGF-PBCA-NP有明顯的緩釋作用。

5 結果與討論

乳化聚合法，是將單體滴入含有藥物及表面活性劑的酸水溶液中，在水中OH－的催化下，發(fā)生陰離子聚合而成，適宜的pH值在2～3之間。該方法操作簡單，但由于pH值條件的限制，制約了酸不穩(wěn)定藥物聚氰基丙烯酸烷酯納米粒的制備。經過前期穩(wěn)定性考察，在所采用的制劑工藝條件下不會破壞bFGF，其中bFGF在pH 2時，2h內保持穩(wěn)定；溫度在37℃時，24h內穩(wěn)定性較好。據(jù)此筆者制備了bFGF-PBCANP。由形態(tài)及其分布和載藥性能考察的試驗結果可見，bFGF-PBCA-NP平均粒徑為（120.5±1.60）nm，EE為（89.35±0.83）%，DL為（4.26±0.02）%；制得的納米粒為規(guī)則的圓球形，表面較光滑；跨距為0.77，表明其粒徑分布較窄，大小較均勻。說明該乳化聚合法簡單易行。

從擬合的模型來看，bFGF-PBCA-NP的體外釋放則較符合多項式與雙相動力學方程，具有明顯的緩釋特性，存在快釋與慢釋2個階段：由于bFGF-PBCA-NP表面吸附的藥物容易脫落并釋放出來，形成快釋現(xiàn)象，快釋階段藥物在治療部位迅速達到有效治療濃度；被包裹于載體材料內部的藥物由于載體材料形成的骨架阻礙了內部藥物的溶解，釋放進入慢釋階段，其作為維持劑量可避免峰谷波動及給藥頻率過快，因而具有較明顯的緩釋作用。

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Study on Preparation andin vitroRelease of bFGF-loaded Nanoparticles

LIU Hui-na1，WANG Wei2
（1.Zhengzhou Orthopaedic Hospital，Zhengzhou 450052，China；2.Pharmacy College of Henan University，Henan Kaifeng 475001，China）

OBJECTIVE：To prepare the basic fibroblast growth factors（bFGF）-loaded nanoparticles（NP），and to study the release behavior of the nanoparticlesin vitro.METHODS：Using biodegradable materialsα-PBCA as carrier，bFGF-PBCA-NP was prepared by emulsion polymerization method.Using diameter and entrapment efficiency as index，orthogonal test was used to optimize the proportion ofα-PBCA（μl）to bFGF（μg），mass fraction of poloxamer F68and pH of solution after added bFGF.The morphology of the nanoparticles was observed with TEM.The particle size and distribution of bFGF-PBCA-NP，entrapment efficiency，drug-loading amount and 72h accumulative drug releasein vitro（Q）were investigated.First order kinetics equation，Higuchi equation，Weibull equation，double exponential biphasic kinetics equation and polynomial equation were fitted.RESULTS：The proportion ofα-PBCA and bFGF was 4.8，and poloxamer F68accounted for 3%with pH of 2.0；bFGF-PBCA-NP were sphere-like solid particle with mean size of（120.5±1.60）nm.The drug-loading amount was（4.26±0.02）%and the encapsulation efficiency was（89.35±0.83）%.Thein vitrorelease properties could be expressed by double exponential biphasic kinetics equation and polynomial equation，and correlation coefficients were 0.9905and 0.9947.CONCLUSIONS：Prepared bFGF-PBCA-NP show significant sustained release.

Basic fibroblast growth factors；α-PBCA；Nanoparticles；Preparation；Orthogonal test；Drug releasein vitro

R944

A

1001-0408（2013）17-1584-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2013.17.18

＊藥師，碩士研究生。研究方向：藥物新劑型與新技術。電話：0371-67771613。E-mail：liuhuina203@163.com

2012-11-06

2012-12-20）

·基本藥物檢定·