劉慧娜，王瑋

（1.鄭州市骨科醫(yī)院，鄭州 450052；2.河南大學藥學院，河南開封 475001）

堿性成纖維生長因子納米粒的制備及體外釋放研究

劉慧娜1＊，王瑋2

（1.鄭州市骨科醫(yī)院，鄭州 450052；2.河南大學藥學院，河南開封 475001）

目的：制備堿性成纖維生長因子（bFGF）納米粒（NP），并考察其體外釋放特性。方法：以生物可降解材料α-氰基丙烯酸正丁酯（PBCA）為載體，采用乳化聚合法制備bFGF-PBCA-NP，并以粒徑和包封率為指標，采用正交試驗優(yōu)選α-PBCA（μl）與bFGF（μg）的比例、泊洛沙姆F68的質(zhì)量分數(shù)和加入bFGF后溶液的pH值；采用電子透射顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)，考察bFGF-PBCA-NP的粒徑及其分布、包封率、載藥量和72h的體外累積釋藥量（Q），并進行一級動力學、Higuchi、Weibull、雙指數(shù)雙相動力學及多項式方程擬合。結(jié)果：α-PBCA與bFGF的比例為4.8，泊洛沙姆F68為3%，pH為2.0；所得納米粒為圓整的類球形實體粒子，平均粒徑為（120.5±1.60）nm，載藥量為（4.26±0.02）%，包封率為（89.35±0.83）%；bFGF-PBCA-NP的體外釋放以雙指數(shù)雙相動力學和多項式方程擬合較好，r分別為0.9905和0.9947。結(jié)論：所制備的bFGF-PBCA-NP具有明顯的緩釋作用。

堿性成纖維生長因子；α-氰基丙烯酸正丁酯；納米粒；制備；正交試驗；體外釋放

冠心病是目前導致人類死亡的主要疾病之一，在我國其發(fā)病率呈逐年增高趨勢，越來越多醫(yī)學工作者在不斷尋求新的冠心病治療方法。治療性血管生成（Therapeutic angiogenesis）或稱“生物搭橋”（Biologic bypass）的方法是目前冠心病治療研究的熱點。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)血管新生過程中，有許多細胞因子的參與，而堿性成纖維生長因子（bFGF）就是其中之一[1]。bFGF具有促進缺血心肌新生血管形成和保護心肌細胞的作用，是“藥物冠脈搭橋”的重要組成部分，適用于冠心病及周圍血管病的治療，其潛在的治療價值已得到心血管界的重視[2]。但是bFGF在體內(nèi)的半衰期為3～10min，全身應用將被快速滅活而難以發(fā)揮其有效作用；在溶液中的穩(wěn)定性較差，局部穿刺分次給藥也難以產(chǎn)生有效作用，并且不適合長期給藥。因此研究bFGF的納米粒對長期維持局部藥物的有效濃度、促進新生血管生長有著重要意義。

1 材料

bFGF試劑盒（上海麥莎生物有限公司分裝）；Bio-tek-Model酶標分析儀（美國Bio-tek Instruments.INC公司）；CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；YP-600型電子天平（上海第二天平儀器廠）；AB135-S電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SHA-C型水浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；JEM-100CX-Ⅱ電子透射顯微鏡（日本電子公司）。

α-氰基丙烯酸正丁酯（α-PBCA，廣州白云醫(yī)用膠股份有限公司）；bFGF凍干粉末（暨南大學生物研究中心，純度：＞95%）；三羥甲基氨基甲烷（上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠）；其他試劑均為市售分析純產(chǎn)品；所用水皆為SZ-93自動雙重純水制備系統(tǒng)制備。

2 bFGF-PBCA微球（NP）的制備

2.1 乳化聚合法制備[3-4]

制備bFGF-PBCA-NP。精密量取5ml含有一定濃度泊洛沙姆F68、pH 7.6的三羥甲基氨基甲烷（Tris）緩沖水溶液，然后加入適量bFGF的超純水溶液，置于恒溫加熱磁力攪拌器上，660r/min持續(xù)攪拌下，用0.1mol/L HCl將pH調(diào)至2.0，以微量注射器精密量取α-PBCA適量并加入高速攪拌的溶液中，1h后，用0.05mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至中性，繼續(xù)攪拌1h即得bFGF-PBCA-NP膠體溶液。同法制備不含bFGF的空白納米粒。

2.2 正交試驗優(yōu)化制備工藝

根據(jù)相關文獻和預試驗確定單因素，通過對制備條件溫度、攪拌速度、攪拌時間、加入bFGF后溶液的pH值、bFGF用量和泊洛沙姆F68濃度進行考察，并以載藥納米粒的粒徑、包封率（EE）和載藥量（DL）為指標，優(yōu)選出影響bFGF-PBCA-NP制備的主要因素有3個：α-PBCA（μl）與bFGF（μg）比例（A）、泊洛沙姆F68質(zhì)量分數(shù)（B）、加入bFGF后溶液的pH值（C）。根據(jù)指標納米粒的粒徑、包封率和載藥量的權重，分別給3個指標0.2、0.5、0.3的權重系數(shù)，采用綜合加權評分法[5-6]，綜合評分＝粒徑min/粒徑×100×0.2+EE/EEmax×100×0.5+DL/DLmax×100×0.3。每個因素選擇3個水平，按正交試驗表L9（33）進行試驗[3]。正交試驗因素與水平見表1，結(jié)果分析見表2、表3。

表1 因素與水平Tab1 Factor and levels

表2 正交試驗結(jié)果Tab2 Results of orthogonal design

表3 正交試驗結(jié)果分析Tab3 Analysis of the results of orthogonal design

R值大小可以看出不同因素對試驗結(jié)果影響的程度。R值越大，說明此因素對所考察指標的影響越大。由表3中的結(jié)果可得，α-PBCA與bFGF比例對DL和EE的影響較大，而粒徑受pH值影響較大。

比較K值大小可了解該因素的不同水平對試驗結(jié)果的影響的程度。對DL和EE而言，K值越大的水平越理想；而對粒徑而言，K值越小的水平越理想。采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對正交試驗進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果表明，α-PBCA與bFGF比例對EE有顯著影響（P＜0.05），而泊洛沙姆F68質(zhì)量分數(shù)和pH值對DL和EE無顯著影響（P＞0.05）；pH值對bFGF-PBCA-NP的粒徑有顯著影響（P＜0.05），α-PBCA與bFGF比例和泊洛沙姆F68質(zhì)量分數(shù)對粒徑無顯著影響（P＞0.05）。

綜合表2和表3的結(jié)果，確定最佳處方和工藝為：A2B3C1，即α-PBCA與bFGF比例為4.8，加入酸后調(diào)節(jié)加入bFGF后溶液的pH值為2.0，泊洛沙姆F68質(zhì)量分數(shù)為3%。

3 納米粒的形態(tài)學及粒徑考察

3.1 納米粒的形態(tài)考察

透射電子顯微鏡照片見圖1，粒徑分布見圖2。

圖1 bFGF-PBCA-NP電鏡照片（×20000）Fig1 TEM micrograph of bFGF-PBCA-NP（×20000）

圖2 bFGF-PBCA-NP粒徑分布圖Fig2 Particle size and distribution of bFGF-PBCA-NP

結(jié)果，制得納米粒為圓球形或類球形，大小較均勻，不粘連，分散良好，粒徑分布較窄，且基本呈正態(tài)分布，平均粒徑為（120.5±1.60）nm。

由圖2可見，制得的納米粒為規(guī)則的圓球形，表面較光滑。D10＝72.5nm，D50＝119.15nm，D90＝164.5nm。根據(jù)跨距的計算方法可得跨距為0.77，表明其粒徑分布較窄，大小較均勻。

3.2 DL、EE的測定

采用離心法[3]，取制得納米粒的膠體溶液適量，置于專用塑料離心管中，配對后放入高速冷凍離心機中離心。運行參數(shù)為：轉(zhuǎn)速15000r/min，溫度設定為4℃。離心2h后，取離心后的上清液適量，采用酶聯(lián)免疫法[7]分別測定m1和m2，按照公式計算DL和EE。

式中，m1為加入的藥物總質(zhì)量（mg）；m2為上清液中藥物質(zhì)量（mg）；m0為制得的納米粒的質(zhì)量（mg）。

結(jié)果，批號為071002、071004、071005的3批bFGF-PBCA-NP的DL與EE分別為4.26%、90.3%，4.24%、89.9%，4.28%、90.7%，平均值分別為（4.26±0.02）%、（89.35±0.83）%。

4 bFGF-PBCA-NP的體外釋藥

4.1 釋放介質(zhì)的選擇

在研究微粒制劑體外釋放時，為模擬體內(nèi)條件，常選擇生理鹽水或磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)。在本研究中，選擇磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）作為釋放介質(zhì)。

4.2 藥物測定方法

bFGF的測定方法采用酶聯(lián)免疫法，依照次序分別精密吸取不同質(zhì)量濃度的bFGF標準品溶液各100μl，標準品質(zhì)量濃度分別為0、50、100、250、500、1000pg/ml，記錄光密度（OD）結(jié)果。以結(jié)合率B/B0（%）（B＝標準品OD值，B0＝標準品0點OD值）對bFGF質(zhì)量濃度（c）進行直線回歸，并繪制標準曲線，得回歸方程為B/B0（%）＝－0.082c+93.316（r＝0.9929），線性范圍為0～1000pg/ml。

4.3 bFGF在釋放介質(zhì)中的穩(wěn)定性考察

將配成一定質(zhì)量濃度的bFGF水溶液置于三角瓶中，放入恒溫振蕩箱中，保持37℃，分別于不同時間取出0.4ml，并補加等體積釋放介質(zhì)。將樣品按照酶聯(lián)免疫試劑盒操作方法將樣品進行處理后，在酶標分析儀上測定樣品在0、1、4、8、12、24、36、48、72h的OD值，并計算質(zhì)量濃度c（pg/ml）。結(jié)果c僅下降8.84%，表明樣品在72h內(nèi)穩(wěn)定，RSD＜2.0%。

4.4 樣品體外釋放[8-9]

將所制得的納米粒膠體溶液補加釋放介質(zhì)至40ml，置于磨口三角錐形瓶中，其中bFGF的理論質(zhì)量濃度約為120ng/ml。將錐形瓶浸入37℃恒溫振蕩器中，維持37℃恒溫振蕩，于不同時間取樣0.4ml，然后補加相同體積的釋放介質(zhì)。在酶標分析儀上測定樣品中bFGF的OD值，并計算累積釋放量（Q），繪制累積釋放曲線。結(jié)果，0、1、2、4、8、12、24、36、72h的Q分別為（0.43±0.50）%、（7.15±0.68）%、（15.65±0.73）%、（21.09±0.71）%、（26.99±0.82）%、（36.71±1.04）%、（4.64±0.94）%、（66.86±1.08）%、（73.92±0.89）%，累積釋放曲線見圖3。

圖372 h內(nèi)bFGF-PBCA-NP累積釋放曲線Fig3 The accumulative release curves of bFGF-PBCA-NP within 72h

4.5 體外釋藥曲線擬合

以Q對時間（t）分別采用一級動力學（Ⅰ）、Higuchi（Ⅱ）、Weibull（Ⅲ）、雙指數(shù)雙相動力學（Ⅳ）及多項式方程（Ⅴ）對釋藥數(shù)據(jù)進行擬合，結(jié)果見表4[AIC＝nlnRe+2P，n為試驗數(shù)據(jù)的個數(shù)，P為所設模型參數(shù)的個數(shù)，Re＝∑Wi（Q擬合－Q）2，Wi為權重]。

表4 不同擬合方程bFGF-PBCA-NP的擬合結(jié)果Tab4 Comparison of in vitro accumulative release data of bFGF-PBCA-NPfitted by different equations

結(jié)果可見，bFGF-PBCA-NP體外釋放曲線一級動力學、Higuchi和Weibull方程擬合均不佳，而雙指數(shù)雙相動力學和多項式方程擬合后效果較好，表明bFGF-PBCA-NP有明顯的緩釋作用。

5 結(jié)果與討論

乳化聚合法，是將單體滴入含有藥物及表面活性劑的酸水溶液中，在水中OH－的催化下，發(fā)生陰離子聚合而成，適宜的pH值在2～3之間。該方法操作簡單，但由于pH值條件的限制，制約了酸不穩(wěn)定藥物聚氰基丙烯酸烷酯納米粒的制備。經(jīng)過前期穩(wěn)定性考察，在所采用的制劑工藝條件下不會破壞bFGF，其中bFGF在pH 2時，2h內(nèi)保持穩(wěn)定；溫度在37℃時，24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。據(jù)此筆者制備了bFGF-PBCANP。由形態(tài)及其分布和載藥性能考察的試驗結(jié)果可見，bFGF-PBCA-NP平均粒徑為（120.5±1.60）nm，EE為（89.35±0.83）%，DL為（4.26±0.02）%；制得的納米粒為規(guī)則的圓球形，表面較光滑；跨距為0.77，表明其粒徑分布較窄，大小較均勻。說明該乳化聚合法簡單易行。

從擬合的模型來看，bFGF-PBCA-NP的體外釋放則較符合多項式與雙相動力學方程，具有明顯的緩釋特性，存在快釋與慢釋2個階段：由于bFGF-PBCA-NP表面吸附的藥物容易脫落并釋放出來，形成快釋現(xiàn)象，快釋階段藥物在治療部位迅速達到有效治療濃度；被包裹于載體材料內(nèi)部的藥物由于載體材料形成的骨架阻礙了內(nèi)部藥物的溶解，釋放進入慢釋階段，其作為維持劑量可避免峰谷波動及給藥頻率過快，因而具有較明顯的緩釋作用。

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Study on Preparation andin vitroRelease of bFGF-loaded Nanoparticles

LIU Hui-na1，WANG Wei2
（1.Zhengzhou Orthopaedic Hospital，Zhengzhou 450052，China；2.Pharmacy College of Henan University，Henan Kaifeng 475001，China）

OBJECTIVE：To prepare the basic fibroblast growth factors（bFGF）-loaded nanoparticles（NP），and to study the release behavior of the nanoparticlesin vitro.METHODS：Using biodegradable materialsα-PBCA as carrier，bFGF-PBCA-NP was prepared by emulsion polymerization method.Using diameter and entrapment efficiency as index，orthogonal test was used to optimize the proportion ofα-PBCA（μl）to bFGF（μg），mass fraction of poloxamer F68and pH of solution after added bFGF.The morphology of the nanoparticles was observed with TEM.The particle size and distribution of bFGF-PBCA-NP，entrapment efficiency，drug-loading amount and 72h accumulative drug releasein vitro（Q）were investigated.First order kinetics equation，Higuchi equation，Weibull equation，double exponential biphasic kinetics equation and polynomial equation were fitted.RESULTS：The proportion ofα-PBCA and bFGF was 4.8，and poloxamer F68accounted for 3%with pH of 2.0；bFGF-PBCA-NP were sphere-like solid particle with mean size of（120.5±1.60）nm.The drug-loading amount was（4.26±0.02）%and the encapsulation efficiency was（89.35±0.83）%.Thein vitrorelease properties could be expressed by double exponential biphasic kinetics equation and polynomial equation，and correlation coefficients were 0.9905and 0.9947.CONCLUSIONS：Prepared bFGF-PBCA-NP show significant sustained release.

Basic fibroblast growth factors；α-PBCA；Nanoparticles；Preparation；Orthogonal test；Drug releasein vitro

R944

A

1001-0408（2013）17-1584-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2013.17.18

＊藥師，碩士研究生。研究方向：藥物新劑型與新技術。電話：0371-67771613。E-mail：liuhuina203@163.com

2012-11-06

2012-12-20）

·基本藥物檢定·