孫成文，李嘉琳，王玉江，徐水英，孫愛麗，趙玉婧，邱澤武

中毒患者血液中普羅帕酮LC-MS/MS檢測方法的建立

孫成文，李嘉琳，王玉江，徐水英，孫愛麗，趙玉婧，邱澤武

目的：建立人血液普羅帕酮LC-MS/MS檢測方法，用于普羅帕酮中毒患者的診斷。方法：取患者靜脈全血，分離血清500μl，加1000μl乙腈混勻，離心沉淀，上清液用針頭濾器過濾，取10μl進(jìn)樣。在串聯(lián)四級桿質(zhì)譜電噴霧電離（ESI）正離子電離模式下，監(jiān)測m/z342.2/116.1和342.2/324.2兩對多反應(yīng)離子（MRM）進(jìn)行普羅帕酮檢測。分析保留時間（RT），確定線性范圍，計(jì)算檢出限、精密度和穩(wěn)定性。結(jié)果：普羅帕酮保留時間為5.08min，在1～1000 ng/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r= 0.9984），最低定量限（LOQ）為0.1ng/mL，日內(nèi)精密度RSD為3.9%，日間精密度RSD為6.0%，平均回收率為96.5%，普羅帕酮在室溫環(huán)境中較為穩(wěn)定。結(jié)論：建立LC-MS/MS檢測普羅帕酮的方法靈敏、快速，特異性好，適用于普羅帕酮中毒患者的診斷與指導(dǎo)治療。

普羅帕酮；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；血液分析；中毒

普羅帕酮，為高效膜抑制性抗心律失常藥。具有膜穩(wěn)定作用及競爭性β阻滯作用。能降低心肌興奮性，延長動作電位時程及有效不應(yīng)期。臨床可用于治療室性和室上性異位搏動，心動過速，預(yù)激綜合征等疾病。近年來，臨床常見誤服或過量服用普羅帕酮導(dǎo)致中毒的現(xiàn)象，患者出現(xiàn)低血壓，心動過緩，傳導(dǎo)阻滯等，嚴(yán)重者還會發(fā)生昏迷、抽搐、重度心律失常甚至死亡[1-2]。檢測血液中普羅帕酮濃度可以協(xié)助臨床中毒患者的診斷與治療。國內(nèi)外已有相關(guān)血液普羅帕酮的液相色譜檢測方法，但多是從藥代動力學(xué)和正常血藥濃度監(jiān)測的角度研究的，不適合臨床普羅帕酮中毒患者的搶救需要[3-5]。液相色譜-質(zhì)譜法具有靈敏度高和選擇性好等特點(diǎn)，本文利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）建立了一種較適合于中毒患者血液普羅帕酮的快速檢測方法。

1 資料和方法

1.1 儀器 超快速液相色譜儀（Prominence UFLC，LC-20AD，日本島津有限公司）、AB SCIEX三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（API3200，LC-MS/MS，配有電噴霧離子源和大氣壓化學(xué)源，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）、Mil l iQ超純水器（美國Mi l l ipore公司）、萬分之一電子分析天平（AG285，瑞士Met t ler-Toledo）、離心機(jī)（LG20-W，北京立離心機(jī)有限公司）。

1.2 試劑 鹽酸普羅帕酮（99.9%，中國計(jì)量科學(xué)研究院）；用1∶1甲醇（HPLC級，F(xiàn)isher Scienti f ic公司）水配制1mg/ml普羅帕酮溶液儲存4℃?zhèn)溆?；乙腈（HPLC級，F(xiàn)isher Scienti f ic公司）；甲酸（分析純，DIMA公司）；乙酸銨（分析純，DIMA公司）；液氮（≥99.9%，北京東方醫(yī)用氣體公司）；純水（18.2MΩ，Mil l iQ超純水器所制）；10份健康人混合血清（解放軍307醫(yī)院輸血科）。

1.3 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線與質(zhì)控樣本 取1mg/mL普羅帕酮儲存液，分別配制1.0 ng/ml、10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml、1000.0 ng/ml濃度的血清樣品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml三個濃度觀察回收率、精密度、穩(wěn)定性等方法學(xué)指標(biāo)。

1.4 樣品前處理 取患者靜脈血液，離心分離血清500μl，加乙腈1000μl，振蕩器震蕩1 min。18 000 rpm高速離心（20 979 g），取上清液1000μl 0.22μm濾膜針頭濾器過濾到樣品瓶，10μl上機(jī)進(jìn)樣。

1.5 儀器分析條件

1.5.1液相色譜條件 色譜柱（Shim-pack XR-ODS 100Lx3.0色譜柱 島津公司），柱溫箱溫度40℃，10μl進(jìn)樣；流動相：A相（5%甲醇水溶液+2mmol乙酸銨+1‰甲酸），B相（95%甲醇水溶液+2mmol乙酸銨+1‰甲酸），分析時間及A、B兩流動相流率變化。見表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧電離（ESI），ESI正離子電離模式下，監(jiān)測m/z 342.2/116.1和342.2/324.2兩對多反應(yīng)離子（MRM）；離子源霧化溫度：450℃；氣簾氣（CUR）10 psi，霧化氣（NEB） 50 psi，碰撞氣（CAD）5psi，電噴霧電壓（IS）4500V，采用MRM模式進(jìn)行正離子檢測。

1.6 定性與定量檢測 在同等條件下比對色譜峰的保留時間及兩對定性離子的相對豐度與普羅帕酮標(biāo)準(zhǔn)品一致，則可判定為普羅帕酮。定量采用外標(biāo)法。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜監(jiān)測離子的選擇 在ESI正離子模式下，用濃度1000 ng/ml的普羅帕酮溶液以針泵10.0μl/min的速度連續(xù)進(jìn)樣質(zhì)譜儀進(jìn)行全掃描，獲得普羅帕酮的[M+H]342.2準(zhǔn)分子離子峰，以其作為母離子進(jìn)行轟擊，獲得普羅帕酮二級全掃描質(zhì)譜。見圖1。選擇信號較強(qiáng)、分子量較大的m/z 342.2/116.1和342.2/324.2兩對離子在MRM模式下，進(jìn)一步優(yōu)化兩對監(jiān)測離子去簇電壓（DP）、射入電壓（EP）、碰撞能（CE）和碰撞池出口電壓（CXP）等參數(shù)。見表2。

2.2 保留時間及特異性 分別取空白血清和100 ng/ml的血清樣品500μl按“1.4”項(xiàng)處理上機(jī)進(jìn)樣10μl，普羅帕酮的保留時間為5.08min，未發(fā)現(xiàn)人血液樣品本底對普羅帕酮有干擾。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限 取1.0ng/ml、10.0ng/ml、100.0ng/ml、500.0ng/ml、1000.0ng/ml 5個濃度的普羅帕酮血清樣品建立曲線。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得線性方程為Y＝1.49× 103X＋1.82×103，r=0.9984。選擇 m/z 342.2/ 116.1定量普羅帕酮，方法檢定量檢出限（LOQ）為0.1 ng/ml（信噪比S/N=10）。

2.4 回 收 率 取 10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml 3個濃度普羅帕酮血清樣品按“1.4”項(xiàng)處理，觀察普羅帕酮的回收率，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。結(jié)果10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml 3個濃度的平均回收率分別為98.3%、96.0%和95.2%，RSD分別為4.8%，4.2%，5.0%。

2.5 日內(nèi)與日間精密度 取10.0ng/ml、100.0ng/ml、500.0 ng/ml 3個濃度普羅帕酮樣品觀察精密度。于第1天內(nèi)測定3個樣品6次，計(jì)算日內(nèi)精密度RSD分別為5.1%，3.5%，3.0%；另分別將這3個樣品于第6天內(nèi)連續(xù)測定，測得3個濃度日間精密度RSD分別為7.5%，4.2%，6.4%。

2.6 穩(wěn) 定 性 將 10.0 ng/ml、100.0 ng/ml、500.0 ng/ml 3個濃度的血清樣品放置室溫觀察普羅帕酮在血清中的穩(wěn)定性。分別于4 h、8 h、24 h測定普羅帕酮濃度，3個樣品每個時間點(diǎn)均進(jìn)樣6次，結(jié)果濃度沒有明顯變化。見表3。表明室溫條件下普羅帕酮在血清中穩(wěn)定性較好。

3 討論

普羅帕酮又稱心律平，化學(xué)名為丙胺苯丙酮，結(jié)構(gòu)中含有電負(fù)性較強(qiáng)的氮元素。見圖2。本文在ESI正離子模式下，對普羅帕酮進(jìn)行Q1和MS2掃描，均獲得了較強(qiáng)的信號響應(yīng)，為選擇LC-MS/MS-ESI正離子模式檢測普羅帕酮提供了基礎(chǔ)；在本方法中，采用“血液0.5ml+乙腈1ml，離心、過濾、上機(jī)進(jìn)樣”的普羅帕酮提取方法，步驟簡短，可大大地縮短檢測時間。平均回收率達(dá)到96.5%，完全可以滿足臨床中毒患者的搶救需要。由于中毒患者有可能服用多種藥物，患者血液中還可能會有治療用藥，成分較為復(fù)雜。所以，在色譜條件中，我們選擇了一個相對復(fù)雜的流動相和梯度洗脫條件，主要目的是為了使樣品中的目標(biāo)化合物均得到較好的分離，以增加檢測的準(zhǔn)確性；因?yàn)楸驹囼?yàn)所涉及對象大多為中毒患者，因此建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時選擇了較寬的濃度范圍，以便能盡量涵蓋重度中毒患者的高血藥濃度。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線r值大于0.99，相關(guān)性較好。如果患者中毒病情較重，普羅帕酮血液濃度較高，超出本方法的線性范圍，可對患者血清進(jìn)行10倍稀釋，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。近年來，利用本方法檢測了11例普羅帕酮過量的患者，男3例，女8例，年齡19～47歲。11例患者血液普羅帕酮濃度范圍為1530～4920 ng/ml，取得了良好效果。

[1]呂方方，李國強(qiáng)，楊 波.普羅帕酮急性中毒致心律失常和呼吸衰竭1例[J].藥物不良反應(yīng)雜志，2011，5（13）：301-302.

[2]孫宏杰，吳 旭，官大威，等.普羅帕酮中毒死亡1例[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2010，6（26）：475-476.

[3]董軍亞，張繼紅，焦曉紅，等.高效液相色譜法測定人血清中普羅帕酮的濃度[J].武警醫(yī)學(xué)，2006，6（17）：427-429.

[4]李東升，張才麗.高效液相色譜法同時測定兔血清中普羅帕酮和奎尼丁的濃度[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，2（10）：238-239.

[5]陳 鷹，裘 軍，吳 梅，等.反相高效液相色譜法選擇性測定血漿中普羅帕酮對映體[J].中國藥師，2000，1（3）：36-37.

（收稿：2013-05-27 修回：2013-06-17 編校：齊 彤）

Foundation of the HPLC-MS/MSmethod to analyze propafenone in blood of poisoned patients

SUN Cheng-wen,LIJia-lin,WANG Yu-jiang,XU Shui-ying，SUN Ai-li，ZHAO Yu-jing，QIU Ze-wu.The 307Hospitalof PLA,Beijing 100071,China

Objective：To establish a HPLC-MS/MSmethod for the testof propafenone in human blood,and diagnose the poisoning patients.Methods：500μl serum divided from venous blood wasmixed w ith 1000μl acetonitrile.After centrifugation and precipitate,10μl samplewas tested from the filtered clear supernatant.The sample preparationwas deproteinized and extracted w ith acetonitrile followed by HPLC-MS/MS inmultiple reactionmonitoringmode,the transition ions ofm/z342.2/116.1 and m/z342.2/ 324.2 were selected for quantification of propafenone,propafenonewas quantified based on external standard calibration curve.Results：The retention time of calibrationwas5.08min，calibration curvewere linear over the range of 1～1000 ng/m L(r=0.9984)and the lower lim itof quantitation(LOQ)was 0.1 ng/m L(S/N=10).The intra-and inter-day precisions(RSD)were 3.9%and 6.0%,respectively.The average extraction recovery was 96.5%.The analysiswas proved to be stable under room temperature.Conclusion：Themethodwas rapidly and easy to usew ith good sensitivity and specificity.Itcan beused for clinicaldiagnosisand treatment.

propafenone；liquid chromatography-tandem mass；blood analysis；poisoning

R 595.4

A

2095-3496（2013）03-0149-03

100071 北京，解放軍307醫(yī)院全軍中毒救治中心（孫成文，李嘉琳，徐水英，孫愛麗，趙玉婧，邱澤武）；北京市豐臺區(qū)疾病預(yù)防控制中心（王玉江）

邱澤武，E-mai l：qiuzw@em120.com