林俊 金洪傳

●綜 述

乳腺癌的DNA甲基化研究進展

林俊 金洪傳

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的疾病，其發(fā)病機制還不是很清楚。隨著研究手段的不斷提高，目前發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)病機制不僅僅局限于基因突變、缺失等遺傳學(xué)變化[1]。隨著表觀遺傳學(xué)的理論研究的深入，DNA甲基化在乳腺癌的病理生理過程中的作用逐漸被揭示。DNA甲基化是指經(jīng)過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化，將由S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基添加到DNA的某些堿基上，在哺乳動物細胞中主要是鳥嘌呤前的胞嘧啶（即CpG中的C）上。作為基因表達的重要調(diào)控方式，DNA甲基化參與胚胎的生長發(fā)育等生理活動，并與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等病理過程密切相關(guān)[2-3]。DNA甲基化調(diào)控基因表達的方式主要包括抑制轉(zhuǎn)錄因子及其協(xié)作因子與基因啟動子間的相互作用，抑制轉(zhuǎn)錄因子以及DNA依賴的RNA聚合酶活性等。DNA的甲基化狀態(tài)可以由親代細胞傳給子代，因此是表觀遺傳學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。啟動子區(qū)DNA的甲基化可導(dǎo)致重要抑癌基因的表達下降，從而促進乳腺癌的發(fā)展[4-5]。筆者就乳腺癌中DNA甲基化的研究進展作一綜述。

1 乳腺癌相關(guān)基因的DNA甲基化

1.1 BRCA1 BRCA1是一種在正常乳腺及卵巢組織中高表達的抑癌基因，在乳腺癌等腫瘤中往往因為突變和雜合缺失導(dǎo)致其功能缺失。近年來發(fā)現(xiàn)在散發(fā)性乳腺癌的患者中存在BRCA1啟動子區(qū)DNA的甲基化[6-8]。研究顯示11%的浸潤性乳腺癌患者中BRCA1基因表達水平很低或者缺失，同時也發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)DNA處于高甲基化狀態(tài)，因此BRCA1基因可能因為DNA甲基化而表達沉默，從而失去了對乳腺癌細胞的生長抑制作用，最終導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生[9]。在髓樣癌和黏液腺癌的發(fā)生過程中，BRCA1基因的甲基化也發(fā)揮了重要作用。組織學(xué)分級高、分化程度低和有淋巴轉(zhuǎn)移的散發(fā)性乳腺癌患者中BRCA1甲基化程度更高，提示BRCA1甲基化在乳腺癌的進展過程中也有一定的作用。

1.2 細胞周期依賴性激酶抑制基因（CDKN2A）/p16 p16是一種細胞周期蛋白酶抑制因子，其編碼基因CDKN2A也是一種常見的抑癌基因。p16與細胞周期蛋白競爭和CDK4、CDK6的結(jié)合位點，使細胞周期在G1/S期發(fā)生阻滯，從而導(dǎo)致細胞增殖能力下降。在很多腫瘤如乳腺癌、肝癌、肺癌等中都出現(xiàn)了CDKN2A基因的甲基化[10-12]。有報道顯示CDKN2A基因在乳腺癌患者中的甲基化率為28.2%,而在良性乳腺疾病患者中卻未發(fā)現(xiàn)CDKN2A基因的甲基化；而且惡性程度高或者伴發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中CDKN2A基因的甲基化程度更高，因此CDKN2A的甲基化對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定的促進作用[10]。

1.3 脆性組氨酸三聯(lián)體基因（FHIT） FHIT基因位于人類染色體3p14.2，包含10個外顯子，編碼區(qū)cDNA全長約1.1kb，編碼的蛋白質(zhì)具147個氨基酸，分子量為16.8kDa。FHIT蛋白是一種DNA損傷修復(fù)蛋白，參與細胞周期調(diào)控等重要生命活動[13]。在正常組織中FHIT基因廣泛表達，而31%的原發(fā)性乳腺癌患者出現(xiàn)了此基因的甲基化，特別是在散發(fā)性乳腺導(dǎo)管癌患者中67%的FHIT基因表達發(fā)生了變化，而這種變化與該基因啟動子區(qū)DNA高甲基化密切相關(guān)[14-15]。

1.4 雌激素受體（ER） ER與很多基因的表達有關(guān)，參與多種生命活動并與乳腺癌發(fā)病過程密切相關(guān)[16]。＞2/3的乳腺癌患者具有ER基因高表達現(xiàn)象，但這些患者的乳腺癌細胞往往增殖能力差，發(fā)展緩慢，患者生存期比較長，也有部分患者在乳腺癌的進展過程中ER轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮?。大約1/3乳腺癌患者ER表達缺失，ER表達缺失的乳腺癌患者癌細胞增殖較快，疾病惡性程度較高，預(yù)后較差[17-18]。目前尚無證據(jù)證明ER表達的缺失是由突變造成的，相反有證據(jù)提示ER陽性的乳腺癌細胞系和正常乳腺細胞中不存在ER基因的甲基化，而ER陰性乳腺癌細胞系及原發(fā)性乳腺癌患者癌細胞中ER基因的甲基化發(fā)生率卻很高。應(yīng)用5-氮-脫氧胞嘧啶等DNA甲基化抑制劑抑制DNA甲基化即可檢測到ER的表達水平顯著升高。

1.5 基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-3（TIMP-3） TIMP-3通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，從而控制腫瘤細胞增殖和遷移[19]。在乳腺癌細胞中檢測到TIMP-3甲基化，而在正常組織中不發(fā)生甲基化，而且該基因的甲基化程度與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān)[20]。

1.6 MDGIMDGI基因編碼蛋白的主要功能是促進乳腺上皮細胞分化為乳腺小泡，分泌乳汁。MDGI基因也因為DNA的甲基化而在乳腺癌組織中低表達[21]。

1.7 共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變基因（ATM） ATM被認為是繼BRCA1之后與乳腺癌的發(fā)病相關(guān)性較高的基因，對細胞周期起到重要的調(diào)控作用。其編碼產(chǎn)物作為一種細胞周期關(guān)卡蛋白，保證在細胞分裂過程中細胞周期的一個階段完全結(jié)束后再開始下一個階段。而在腫瘤細胞中經(jīng)常存在關(guān)卡蛋白的缺失，DNA復(fù)制速度增加，細胞增殖能力提高。有報道在晚期乳腺癌患者細胞中檢測到了ATM的甲基化，而且其表達水平與甲基化狀態(tài)有關(guān)[22-23]。

1.8 RAS相關(guān)區(qū)域家族1A基因（RASSF1A） 作為候選抑癌基因，RASSF1A基因在正常組織中廣泛表達，而在已報道的多種惡性腫瘤中,呈明顯的低水平表達或表達缺失[24]。關(guān)于該基因表達異常的原因，目前研究傾向于與基因啟動子發(fā)生了高甲基化有關(guān)。在散發(fā)性乳腺癌患者的癌組織中，33.3%RASSF1A基因表達缺失，其余有不同程度低表達，而癌旁組織和良性乳腺腫瘤組織中RASSF1A基因均有表達，故研究者推測RASSF1A蛋白可能參與阻斷RAS激活的信號途徑或抑制內(nèi)源性Cyclin-D1、Cyclin-D3的積累，使細胞周期阻斷在G1/S期，從而抑制惡性細胞增殖[25]。

2 乳腺癌相關(guān)基因DNA甲基化的臨床意義

有研究證實，約30%的乳腺腫瘤患者中ER基因表達缺乏同時表現(xiàn)出對內(nèi)分泌治療的耐受，而ER的表達缺乏與基因啟動子甲基化相關(guān)，這就說明ER基因啟動子的甲基化狀態(tài)能夠一定程度上預(yù)示患者對內(nèi)分泌治療的反應(yīng)性。同樣，乳腺癌患者血清中RASSF1A基因的過甲基化狀態(tài)能夠預(yù)示患者對他莫西芬治療的耐受。近年來人們又發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及ER均陽性的乳腺癌患者在蒽環(huán)類藥物輔助化療后，其CDO1基因啟動子DNA的甲基化情況可作為治療后轉(zhuǎn)移情況的預(yù)測指標[26]。

3 DNA甲基化在乳腺癌相關(guān)腫瘤標志物開發(fā)中的價值

因DNA甲基化而表達下調(diào)的乳腺癌相關(guān)抑癌基因發(fā)生去甲基化后，其表達以及抑癌功能就可以恢復(fù)，因此可以抑制乳腺癌進展。在臨床上，包括5-氮-脫氧胞嘧啶在內(nèi)的一系列非特異性的抑制劑均能夠通過改變抑癌基因的甲基化程度來發(fā)揮乳腺癌治療作用。作為胞苷類似物，5-氮-脫氧胞嘧啶抑制DNA甲基化的主要原理是可摻入DNA并抑制甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）催化的DNA甲基化。小劑量5-氮-脫氧胞嘧啶可作用于細胞分裂過程，持續(xù)規(guī)律給藥后可實現(xiàn)癌細胞最大程度上的去甲基化[27]。需注意的是，5-氮-脫氧胞嘧啶在去甲基作用時會導(dǎo)致骨髓抑制的不良反應(yīng)，而且半衰期較短，致使藥效持續(xù)時間短。為克服這些缺點，目前正在研制一種新型的抗腫瘤藥物zebularine。研究發(fā)現(xiàn)zebularine能夠使7種人類腫瘤細胞系中25%～60%甲基化基因去甲基化[28]，而且具有很好的穩(wěn)定性及很低的細胞毒性，在臨床上可以實現(xiàn)口服和腹膜內(nèi)注射兩種方式給藥。

目前很多抑制甲基化的生物制劑應(yīng)用于臨床和食品添加劑，比如普魯卡因胺、沒食子酸鹽（EGCG）。這些物質(zhì)去甲基功能的發(fā)現(xiàn)對癌癥的早期預(yù)防起到了一定的效果，但臨床應(yīng)用還需要進一步的研究和驗證。研究中人們還發(fā)現(xiàn)地西他濱能夠激活沉默的腫瘤抑制因子，組蛋白去乙?；敢种苿↙AQ824）能夠激活已經(jīng)停止分裂的細胞的細胞周期[29]，因此在臨床上可將這些藥物與小劑量5-氮-脫氧胞嘧啶核苷聯(lián)合應(yīng)用以產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果。例如低劑量的5-氮-脫氧胞嘧啶核苷聯(lián)合曲古菌素A（TSA）就能夠促進ER陰性的乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞中的ER重新表達。因此抑制乳腺癌相關(guān)基因DNA甲基化的治療往往可以選擇聯(lián)合用藥，以實現(xiàn)療效的最優(yōu)化。

4 小結(jié)

對乳腺癌相關(guān)基因DNA甲基化的多角度多層次研究使人們對乳腺癌的診斷、治療甚至是對轉(zhuǎn)歸和預(yù)后有了更深層次的認識。雖然DNA甲基化與腫瘤發(fā)生有高度的一致性，目前尚沒有明確的證據(jù)證明這兩者的相關(guān)性，故對于乳腺癌細胞中DNA甲基化的病理生理機制還需要進一步深入的研究[30]。目前臨床對于抑制腫瘤甲基化方面的治療并不成熟，大多數(shù)藥物在療效、給藥途徑及不良反應(yīng)方面還存在很大缺陷。為此，需要進一步深入研究尋找更好的的DNA甲基化診斷方法，研制出更高效低毒的去甲基化藥物，來實現(xiàn)對乳腺癌患者的早期診斷和有效治療。

[1]Gheibi A,Kazemi M,Baradaran A,et al．Study of promotermethylation pattern of 14-3-3 sigma gene in normal and cancerous tissue of breast:A potential biomarker for detection of breast cancer in patients[J]．Adv Biomed Res,2012,1:80．

[2]Sturgeon S R,Balasubramanian R,Schairer C，et al．Detection of promoter methylation of tumor suppressor genes in serum DNA of breast cancer cases and benign breast disease controls[J]．Epigenetics,2012,7(11):1258-1267．

[3]Qiu P,Zhang L．Identification of markers associated with global changes in DNA methylation regulation in cancers[J]．BMC Bioinformatics,2012,13(Suppl 13):S7．

[4]Nichols H,Sandler D,DeRoo L,et al．Hormonal risk factors for breast cancer and DNA methylation[J]．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2013,22(3):471-472．

[5]Brown N J,Higham S E,Perunovic B,et al．Lactate dehydrogenase-B is silenced by promoter methylation in a high frequency of human breast cancers[J]．PLoS One,2013,8(2):e57697．

[6]Hsu N C,Huang Y F,Yokoyama K K,et al．Methylation of BRCA1 promoter region is associated with unfavorable prognosis in women with early-stage breast cancer[J]．PLoS One,2013,8(2): e56256．

[7]Hasan T N,Leena Grace B,Shafi G,et al．Association of BRCA1 promoter methylation with rs11655505(c．2265C＞T)variants and decreased gene expression in sporadic breast cancer[J]．Clin Transl Oncol,2013,15(7):555-562．

[8]Hansmann T,Pliushch G,Leubner M,et al．Constitutive promoter methylation of BRCA1 and RAD51C in patients with familial ovarian cancer and early-onset sporadic breast cancer[J]．Hum Mol Genet,2012,21(21):4669-4679．

[9]Pang D,Zhao Y,Xue W,et al．Methylation profiles of the BRCA1 promoter in hereditary and sporadic breast cancer among Han Chinese[J]．Med Oncol,2012,29(3):1561-1568．

[10]Wang L,Tang L,Xie R,et al．p16 promoter hypermethylation is associated with increased breast cancer risk[J]．Mol Med Rep, 2012,6(4):904-908．

[11]Lee J J,Ko E,Cho J,et al．Methylation and immunoexpression of p16(INK4a)tumor suppressor gene in primary breast cancer tissue and their quantitative p16(INK4a)hypermethylation in plasma by Real-time PCR[J]．Korean J Pathol,2012,6(6):554-561．

[12]Tao M H,Mason J B,Marian C,et al．Promoter methylation of E-cadherin,p16,and RAR-beta(2)genes in breast tumors and dietary intake of nutrients important in one-carbon metabolism [J]．Nutr Cancer,2011,63(7):1143-1150．

[13]Yin D T,Wang L,Sun J,et al．Association of the promoter methylation and protein expression of Fragile Histidine Triad (FHIT)gene with the progression of differentiated thyroid carcinoma[J]．Int J Clin Exp Pathol,2010,3(5):482-491．

[14]Syeed N,Husain S A,Sameer A S,et al．Mutational and promoter hypermethylation status of FHIT gene in breast cancer patients of Kashmir[J]．Mutat Res,2011,707(1-2):1-8．

[15]Raish M,Dhillon V S,Ahmad A,et al．Promoter hypermethylation in tumor suppressing genes p16 and FHIT and their relationship with estrogen receptor and progesterone receptor status in breast cancer patients from Northern India[J]．Transl Oncol, 2009,2(4):264-270．

[16]Garcia-Closas M,Couch F J,Lindstrom S,et al．Genome-wide association studies identify four ER negative-specific breast cancer risk loci[J]．Nat Genet,2013,45(4):392-398．

[17]Izadi P,Noruzinia M,Karimipoor M,et al．Promoter hypermethylation of estrogen receptor alpha gene is correlated to estrogen receptor negativity in Iranian patients with sporadic breast cancer[J]．Cell J,2012,14(2):102-109．

[18]Izadi P,Mehrdad N,Foruzandeh F,et al．Association of poor prognosis subtypes of breast cancer with estrogen receptor alpha methylation in Iranian women[J]．Asian Pac J Cancer Prev, 2012,13(8):4113-4117．

[19]Hoque M O,Prencipe M,Poeta M L,et al．Changes in CpG islands promoter methylation patterns during ductal breast carcinoma progression[J]．Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2009,18(10):2694-2700．

[20]Hsu C H,Peng K L,Kang M L,et al．TET1 suppresses cancer invasion by activating the tissue inhibitors of metalloproteinases [J]．Cell Rep,2012,2(3):568-579．

[21]Liggett T E,Melnikov A A,Marks J R,et al．Methylation patterns in cell-free plasma DNA reflect removal of the primary tumor and drug treatment of breast cancer patients[J]．Int J Cancer, 2011,128(2):492-499．

[22]Flanagan J M,Munoz-Alegre M,Henderson S,et al．Gene-body hypermethylation of ATM in peripheral blood DNA of bilateral breast cancer patients[J]．Hum Mol Genet,2009,18(7):1332-1342．

[23]Brennan K,Garcia-Closas M,Orr N,et al．Intragenic ATM methylation in peripheral blood DNA as a biomarker of breast cancer risk[J]．Cancer Res,2012,72(9):2304-2313．

[24]Kloten V,Becker B,Winner K,et al．Promoter hypermethylation of the tumor-suppressor genes ITIH5,DKK3,and RASSF1A as novel biomarkers for blood-based breast cancer screening[J]．Breast Cancer Res,2013,15(1):R4．

[25]da Costa Prando E,Cavalli L R,Rainho C A．Evidence of epigenetic regulation of the tumor suppressor gene cluster flanking RASSF1 in breast cancer cell lines[J]．Epigenetics, 2011,6(12):1413-1424．

[26]Dietrich D,Krispin M,Dietrich J,et al．CDO1 promoter methylationisabiomarkerforoutcomepredictionofanthracycline treated,estrogen receptor-positive,lymph node-positive breast cancerpatients[J]．BMCCancer,2010,10:247．

[27]Niwa T,Toyoda T,Tsukamoto T,et al．Prevention of Helicobacter pylori-Induced Gastric Cancers in Gerbils by a DNA Demethylating Agent[J]．Cancer Prev Res(Phila),2013,6(4): 263-270．

[28]Nakamura K,Aizawa K,Nakabayashi K,et al．DNA methyltransferase inhibitor zebularine inhibits human hepatic carcinoma cells proliferation and induces apoptosis[J]．PLoS One,2013,8(1):e54036．

[29]Jing F,Jun L,Yong Z,et al．Multigene methylation in serum of sporadic Chinese female breast cancer patients as a prognostic biomarker[J]．Oncology,2008,75(1-2):60-66．

[30]Heichman K A,Warren J D．DNA methylation biomarkers and their utility for solid cancer diagnostics[J]．Clin Chem Lab Med, 2012,50(10):1707-1721．

2013-06-18）

（本文編輯：胥昀）

衛(wèi)生部浙江省共建項目（N20120542）

310016 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所（林俊系碩士研究生，現(xiàn)在建德市第二人民院腫瘤科工作）

金洪傳，E-mail:jinhc@zju.edu.cn