劉翠梅，白燕平

（1．中國人民公安大學，北京 100038；2．公安部禁毒情報技術中心，北京 100193）

超聲輔助固相萃取-HPLC法
測定不同地區(qū)繳獲鴉片樣品中生物堿

劉翠梅1，2，白燕平2

（1．中國人民公安大學，北京 100038；2．公安部禁毒情報技術中心，北京 100193）

目的 本文建立了超聲輔助固相萃取-HPLC法定量測定繳獲鴉片樣品中嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀5種生物堿并同時檢出6種未知化合物的方法。采用主成分分析法區(qū)分不同地區(qū)繳獲的鴉片樣品。方法 采用超聲輔助固相萃取法提取生物堿，XDB-C18（5μm×4.6mm×250mm）色譜柱，流動相為10mM的1-庚烷磺酸鈉（pH 3.2）和乙腈，梯度洗脫，紫外檢測器檢測。結果 該方法的定量限為0.58~2.78 mg/kg。添加水平在0.2～1.5mg/mL范圍內，平均加標回收率為81.0%～99.2%，相對標準偏差為1.6%～5.0%。結論 本方法重現(xiàn)性好、定量準確，滿足定量檢測鴉片中生物堿含量并對不同產地鴉片進行分類的需要。

超聲輔助固相萃??；主成分分析；鴉片；生物堿

鴉片是一年生草本植物―罌粟未成熟蒴果經割傷果皮后，滲出之白色乳汁干燥凝固而得。生鴉片中含有30多種生物堿，其中含量較高的是嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因，此外還含有那碎因、隱晶堿、7-氧二氫蒂巴因、東罌粟堿、牛心果堿、可旦民堿、勞丹尼定、隱晶堿、勞丹素、去甲基勞丹素等其它含量較低的生物堿[1]。

由于受到氣候、土壤、水源等自然環(huán)境的影響，生長于不同地域罌粟的品質有所不同，從而造成不同地域鴉片中所含生物堿的種類和含量有很大的差別。制毒分子從鴉片中提取得到粗制嗎啡，將粗制嗎啡二乙?；磻笾频煤Ｂ逡颉Ｓ捎谑艿教崛?、合成、純化方法的限制，或基于“制毒成本”的考慮，制毒分子制得的粗制嗎啡和海洛因中往往殘留多種鴉片類生物堿，鴉片中生物堿的差異在相應的粗制嗎啡和海洛因中也有所體現(xiàn)。因此檢測鴉片中的生物堿，建立不同地區(qū)鴉片樣品的生物堿含量數(shù)據(jù)庫，對區(qū)分鴉片的產地、研究粗制嗎啡提取批次、海洛因合成批次、進一步細化海洛因的產地都有很重要的意義。

鴉片樣品中生物堿的萃取方法主要有液液萃取法、固相萃取法、超聲輔助固相萃取法。液液萃取法所需消耗溶劑量大，步驟繁瑣。超聲輔助固相萃取提取結合了超聲提取時間短、效率高、操作簡便和固相萃取所需溶劑量小、可選擇性地去除基質干擾、萃取效率高的優(yōu)點，是一種較為理想的生物堿萃取方式[2]。

鴉片生物堿的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[3]、液相色譜法（HPLC）[4-5]、毛細管電泳法（CE）[6-7]、液相色譜質譜聯(lián)用法（HPLC-MS）[1]，本文采用反相液相色譜法對鴉片樣品中的5種已知和6種未知生物堿進行了檢測，并嘗試采用主成分分析法對不同地區(qū)繳獲的鴉片樣品進行了分類。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津DGU-20A高效液相色譜儀，超聲波清洗器（KQ 3200E），IKA 渦旋混合器，固相萃取儀（MμLti-SPE M08），氮吹儀（Anke TDL-60B），離心機（MTN-2800D）陽離子交換固相萃取柱（WatersoasisMCX1cc）。

1-庚烷磺酸鈉（純度99.0%，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；其它試劑均為分析純。超純水由Millipore純水系統(tǒng)制備。

鹽酸嗎啡、磷酸可待因、罌粟堿、那可汀、蒂巴因均購自國家藥品生物制品檢定所。

1.2 對照品溶液配制

將嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀、蒂巴因配成10mg/mL儲備液，在5℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1樣品前處理

鴉片樣品于55℃真空干燥，干燥后用瑪瑙研缽研磨均勻。

準確稱取150mg鴉片樣品，加入7.5mL提取溶劑，超聲 30min，離心，移取上清液，在濾渣中加入7.5mL提取溶劑同法提取第二次，合并兩次上清液。取1mL上清液上陽離子交換固相萃取柱。上樣前分別用1mL的甲醇和1mL0.1M的鹽酸對固相萃取柱進行活化。上樣后分別用1mL 0.1M鹽酸和1mL甲醇對固相萃取柱進行淋洗，并抽干溶劑。用氨化甲醇（甲醇-28%氨水，95∶5）1mL，0.5mL 洗脫兩次，收集洗脫液，將洗脫液用氮吹儀40℃吹干，加入1mL甲醇，超聲溶解，過0.45μm濾膜，進HPLC分析。

1.3.2 HPLC分析條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（5μm×4.6mm×250mm），柱溫：40℃，進樣體積：3μL，流速：1mL/min，檢測波長：280nm。

流動相：（A）10mM 1-庚烷磺酸鈉（1.0g溶于390mL水中），用磷酸調pH為3.2；（B）乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結果與討論

2.1 流動相的pH選擇

流動相的pH會改變生物堿的解離狀態(tài)，從而改變其保留時間，為此本文考察了不同pH條件下5種生物堿保留時間的漂移。實驗嘗試了2.8、3.0、3.2、3.4、3.6共5種pH條件，結果表明pH為2.8、3.0、3.2、3.4時，保留時間變化不大，保留時間相對標準偏差（RSD）分別為：嗎啡0.62%，可待因0.26%，蒂巴因0.42%，罌粟堿0.39%，那可汀0.74%。pH為3.6時5種化合物的保留時間有較大改變。最終選定的pH為3.2。

2.2 萃取溶劑的考察

不同溶劑對生物堿的提取效率不同。本文考察了甲醇、80%甲醇/水，50%甲醇/水，2.5%乙酸，5%乙酸這5種常見的提取溶劑的提取效率。稱取50mg鴉片樣品，分別加入5mL提取溶劑，超聲30min，5000r/min離心10min，取上清液過0.45μm濾膜，進HPLC進行分析。

結果表明甲醇的提取效率高于80%甲醇/水和50%甲醇/水。2.5%乙酸和5%乙酸的提取效果相當。當選用甲醇為提取溶劑時，蒂巴因、罌粟堿、那可汀的提取效率最高，選用2.5%或5%乙酸時，嗎啡、可待因的提取效率最高。

2.3 洗脫溶劑的考察

不同洗脫溶劑對生物堿的洗脫效率也會有差異。本文考察了采用2.5%乙酸和甲醇為萃取溶劑時，二氯甲烷/丙酸、氯仿/異丙醇、氨化甲醇三種洗脫溶劑洗脫效果。

方法A：萃取溶劑：2.5%乙酸（上柱前先用氨水調節(jié)上清液pH為9.0）；洗脫溶劑：二氯甲烷/丙酸（二氯甲烷 ∶丙酸=9∶1）

方法B：萃取溶劑：2.5%乙酸（上柱前先用氨水調節(jié)上清液pH為9.0）；洗脫溶劑：氯仿/異丙醇（氯仿∶異丙醇=3∶1）

方法C：萃取溶劑：2.5%乙酸，洗脫溶劑；氨化甲醇（甲醇 ∶28%氨水=95∶5）

方法D：萃取溶劑：甲醇，洗脫溶劑；氨化甲醇（甲醇：28%氨水=95：5）

圖1 不同萃取和洗脫溶劑效果圖

由圖1結果表明，同樣采用2.5%乙酸作為萃取溶劑時，二氯甲烷/丙酸（A）、氯仿/異丙醇（B）、氨化甲醇（C）三種洗脫體系中氨化甲醇的洗脫效果最好。當選用氨化甲醇洗脫體系時，萃取溶劑在上樣前省去了調節(jié)pH這一繁瑣的步驟，操作過程更加簡便。

方法C和D分別選用2.5%乙酸和甲醇作為萃取溶劑，均采用氨化甲醇作為洗脫溶劑。結果表明選用方法C時測得的嗎啡、可待因含量較高，選用方法D時測得的蒂巴因、罌粟堿、那可汀含量較高。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

將嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀配制成0.01mg/mL，0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.5mg/mL，1mg/mL，2mg/mL的混合標準曲線，進樣分析，以樣品峰面積為縱坐標，樣品濃度為橫坐標，獲得標準曲線，見表2。在所測的濃度范圍內，5種化合物的線性關系良好（r≥0.9991）。

按照國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）的定義，檢出限以信噪比S/N〉3計，定量限以S/N〉10計，將混合生物堿標準品稀釋后進樣，得到樣品的檢出限和定量限。結果見表2。

表2 各生物堿的線性范圍和檢出限

2.5 精密度和加標回收率的考察

取某一鴉片樣品作為基質樣品，分別添加0.2mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL的3個不同濃度水平的混合標準溶液，按1.3.1方法進行前處理，每個濃度水平平行做6次。將測得的加標后樣品中生物堿的含量值扣除樣品本身生物堿的含量值得到添加生物堿的測定值，該測定值與理論添加值的比值即為加標回收率。各化合物平均加標回收率為85%～109%，RSD為1.6%～5.0%，結果見表3。

表3 樣品加標回收率和相對標準偏差 n=6

3 樣品測定

選取繳獲地分別為云南、甘肅、河北、貴州、內蒙5個地區(qū)的共58份鴉片樣品，采用甲醇為萃取溶劑，按1.3.3方法進行前處理，進HPLC分析。

圖2 實際鴉片樣品的色譜圖

圖2為測得的某一鴉片樣品的色譜圖，從圖2色譜圖可以看出，除了嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可汀5種已知的生物堿外，還同時檢出6未知生物堿類化合物（色譜圖中用1-6標記），這6種未知化合物存在于多數(shù)鴉片樣品中，且不同樣品含量差異較大。在后期的工作中，筆者會嘗試采用液相色譜質譜聯(lián)用儀、核磁等手段對這6種未知生物堿進行定性分析。

表4為各繳獲地5種生物堿的平均含量，河北、內蒙樣品中嗎啡的平均含量最高，云南樣品中嗎啡的平均含量最低。貴州樣品中罌粟堿、那可汀的平均含量最高。

表4 鴉片樣品5種生物堿平均含量匯總表 單位：%

采用主成分分析法對11種生物堿的峰面積數(shù)據(jù)進行計算，采用主成分1和主成分2作圖，分類結果見圖3。

圖3 不同地區(qū)鴉片樣品PCA分類結果

58份樣品大體分為四組，第一組為內蒙和河北樣品，從圖3中也可以看出，與其它樣品相比內蒙和河北樣品中嗎啡的平均含量最高、罌粟堿和那可汀的平均含量最低，嗎啡和罌粟堿的平均含量數(shù)值高度一致。第二組為貴州樣品，這些樣品的罌粟堿、那可汀平均含量最高。云南的樣品大致分為差異顯著的兩組，這兩組樣品間罌粟堿和那可汀的含量有較大差異。甘肅樣品較分散，散落在河北與貴州樣品之間。

4 結論

本文建立了超聲輔助固相萃取-液相色譜分析不同地域繳獲鴉片樣品中生物堿的方法。超聲輔助固相萃取法快速、高效、消耗萃取溶劑少、操作簡便，是較為理想的萃取方法。文中考察了幾種常見的萃取和洗脫溶劑，結果表明采用甲醇或2.5%乙酸進行萃取，氨化甲醇進行洗脫的操作簡便、效率超高。本方法可定量測定繳獲鴉片樣品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀和蒂巴因，并同時檢出6種未知生物堿。采用利用主成分分析法分析這11種生物堿數(shù)據(jù)，可將58份不同地域繳獲的鴉片樣品大致分成差異明顯的4類。

在后期的工作中，筆者將采用該方法開展對近三年全國繳獲的鴉片樣品的分析工作，初步建立我國繳獲鴉片樣品生物堿含量數(shù)據(jù)庫。逐漸增加的鴉片樣品的生物堿信息將對現(xiàn)有分類結果進一步驗證或修正，從而實現(xiàn)采用鴉片樣品的生物堿分析結果判別鴉片樣品產地的目的。

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[2]周小華，汪群杰.固相萃取技術與應用[M].北京：科學出版社，2010：12-14.

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Determination of Opium Alkaloids by HPLC with Ultrasound Assisted Solid Phase Extraction and Its Application in Source Identification

LIU Cui-mei1，2，BAI Yan-ping2
（1.Chinese People’s Public Security University，Beijing 100038，China；2.The Drug Intelligence and Forensic Center of Minister of Public Security，Beijing 100193，China）

Objective To develop a rapid and reliable method for simultaneous determination of morphine， codeine， thebaine，papaverine，noscapine and 6 other unknown compounds in seized opium samples by high performance liquid chromatography with ultrasonic assisted solid phase extraction.Method Ultrasonic assisted solid phase extraction was used to extract alkaloids.Target analytes were separated on a XDB-C18 column （5 μm×4.6 mm×250 mm）， and were gradiently eluted with the binary mobile phase containing 10 mM sodium heptane-1-sulphonate （pH3.2） and acetonitrile.Results LOQ of different alkaloids ranged from 0.58 to 2.78 mg/mL.Recoveries at 0.2-1.5 mg/mL ranged from 81.0%-99.2%and RSD%was 1.6%-5.0%.The PCA divided 58 seized samples into 4 groups.Conclusion The established method is of high reproducibility and accuracy.It can be applied to determining the alkaloids in opium samples and discriminating different sources of opium.

ultrasound assisted solid phase extraction；principle component analysis（PCA）；opium；alkaloid.

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2013.02.008

1671-2072-（2013）02-0031-04

2012-11-11

國家科技支撐計劃（2011BAK04B06）

劉翠梅（1983—），女，博士研究生，主要從事毒品原產地和關聯(lián)性判別分析研究。E-mail：liucuimei123@yahoo.cn。

卓先義）

鑒定實踐Forensic Practice