楊蓉娟 許艷蕾 劉雪琴 魏麗莉

·論著·

端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸對子宮內(nèi)膜癌細胞株的影響

楊蓉娟 許艷蕾 劉雪琴 魏麗莉

目的觀察端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸對癌細子宮內(nèi)膜癌細胞株的作用。方法用端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸與子宮內(nèi)膜細胞株共同溫育一定時間后，觀察細胞形態(tài)變化，檢測細胞Bcl-2蛋白表達情況，測定端粒酶活性。結(jié)果端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸能誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，抑制端粒酶活性，在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為出現(xiàn)細胞質(zhì)濃縮，變圓，核染色不均勻，核物質(zhì)邊聚成新月形或塊壯;電泳呈凋亡特征性Ladder帶;流式細胞儀分析顯示，反義寡核苷酸在細胞進入DNA合成期前引起DNA損傷，使細胞停滯在G0～G1期，并誘導(dǎo)細胞凋亡。結(jié)論端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸能抑制端粒酶活性，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，從而抑制子宮內(nèi)膜癌的增殖。

端粒酶;子宮內(nèi)膜癌細胞;反義寡聚脫氧核苷酸;凋亡

近年來子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率占全世界常見惡性腫瘤的第七位，為女性生殖道惡性腫瘤之一。隨著生活方式的改變，發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，有研究表明，95%的子宮內(nèi)膜癌組織的端粒酶陽性［1］，端粒酶子宮內(nèi)膜癌中高表達，而在大多數(shù)正常組織中幾乎不表達，使其成為治療肺癌的重要靶點之一。筆者前期的研究證實，端粒酶反義寡核苷酸能夠抑制子宮內(nèi)膜癌細胞生長［2］，本文進一步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 HTERT反義寡核苷酸的設(shè)計合成 從基因庫中查出hTERT反義寡核苷酸的堿基序列，設(shè)計出互補于起始密碼子區(qū)的反義片段，選擇起始密碼子上游6個堿基及后續(xù)的14個堿基，共 20個堿基長度為作用的靶序列的反義寡核苷酸(ASODN)另外合成一段hTERT基因的正義寡核苷酸(SODN)作為對照，每一條鏈均進行全硫代修飾。由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，寡核苷酸貯藏于－20℃冰箱中備用，使用時用雙蒸水溶解稀釋成所需濃度。

1.2 子宮內(nèi)膜癌細胞株 購于北京醫(yī)科大學(xué)一醫(yī)院實驗室。采用含10%新生牛血清(56℃滅活30 min滅活)、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、95%飽和濕度條件下培養(yǎng)于二氧化碳培養(yǎng)箱，0.25%胰酶消化，每周傳代培養(yǎng)2～3次。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 子宮內(nèi)膜癌細胞株 于10%新生牛血清(56℃滅活30 min滅活)、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁生長，0.25%胰酶消化，每周傳代2～3次，實驗所用細胞保持在對數(shù)生長，分為反義組，正義組，空白對照組。分別加入含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液并加入不同濃度的寡核苷酸終濃度分別為5 μmol/L，10 μmol/L，15 μmol/L，每孔設(shè)3個復(fù)孔。空白對照組加入等量的培養(yǎng)液。24 h更換相應(yīng)濃度的寡核苷酸1次。

1.4 端粒酶活性 5 μmol/L ASODN-t作用3 d后，胃癌細胞端粒酶活性測定吸光度值A(chǔ)為0.051±0.006，活性明顯受到抑制，正義組(0.129±0.018)與空白組(0.142±0.004)活性很高。反義組與正義組、空白組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

1.5 Giemsa染色法觀察細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞消化傳代后，活細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度為0.5×106接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，細胞貼壁生長24 h后，棄去上清液，用不含新生小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)24 h后，分為反義組，正義組，空白對照組。分別加入含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液并加入寡核苷酸終濃度5 μmol/L培養(yǎng)48 h。常規(guī)胰酶消化細胞，提取細胞，取100 μl于載玻片上自然涼干，滴加磷酸緩沖液稀釋的Giemsa染色液，室溫放置3～5 min，用自來水沖玻片背面將染料沖凈，自然涼干后，樹脂封片，再蓋以蓋玻片。置光學(xué)纖維鏡下觀察攝像。

1.6 DNA ladder測定 取對數(shù)生長期細胞消化傳代后，調(diào)整細胞濃度為0.5×106接種于30 ml培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，細胞貼壁生長24 h后，棄其培養(yǎng)液，用不含小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)24 h后，棄去培養(yǎng)液，分別加入10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液加入5 μmol/L、10 μml/L、15 μml/L不同濃度反義核苷酸和10 μml/L正義苷酸繼續(xù)培養(yǎng)48 h，并設(shè)空白對照組。收集細胞，提取細胞核中的DNA。與1.5%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含溴化乙啶)電泳，50V 3 h，置凝膠分析成像系統(tǒng)內(nèi)觀察結(jié)果并記錄。

1.7 Bcl-2蛋白定量檢測 采用間接免疫熒光標(biāo)記法，去除樣品中70%乙醇，用0.01 mmol/L PBS緩沖液洗滌2次，將細胞調(diào)整為1×106個/ml，每份樣品中加入 鼠抗人單克隆抗體，工作液濃度為1∶100，在37℃度水浴中溫浴30 min，然后用PBS緩沖液洗滌2次，棄上清;每份樣品中加入二抗即羊抗FITGIG，工作液濃度為1∶100，37℃水浴中溫浴30 min，再用PBS緩沖液洗滌2次，棄上清，以去除未結(jié)合的多余抗體.上機檢測前加入1 ml PBS溶液，經(jīng)400目篩網(wǎng)過濾，采用FACS-420型流式細胞儀檢測Bcl-2蛋白表達情況，每份樣品檢測1萬個細胞，每組共檢測3個樣本，重復(fù)3次。結(jié)果分析以熒光指數(shù)(fluorescence index，F(xiàn)I)表達相對含量，計算公式為:FI=(樣品Bcl-2蛋白表達的平均熒光強度－對照樣品平均熒光強度)/對照樣品平均熒光強度。

1.8 流式細胞儀分析 取對數(shù)生長期細胞消化后，調(diào)整細胞濃度為0.5×106接種于25 ml培養(yǎng)瓶，細胞貼壁生長24 h后，棄去培養(yǎng)液用不含新生小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，分別加入 2.5 μmol/L，5 μmol/L，10 μmol/L不同濃度的寡核苷酸和10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)3瓶，被檢細胞于加寡核苷酸48 h后同時收集反義組，正義組和空白組細胞，用PBS洗滌兩遍，70%冷乙醇固定待測。

1.9 凋亡細胞和細胞周期的檢測 結(jié)果分析:DNA組方圖上出現(xiàn)在G0/G1期細胞峰前小于2C DNA含量的小峰，即為凋亡峰。DNA細胞周期則通過BD公司提供的相應(yīng)的流式細胞分析軟件，計算出細胞周期各時相分布百分比，依據(jù)細胞時相分布計算出細胞增殖指數(shù)，其公式為:PI=［(S+G2M)/(G0+S +G2M)］10。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學(xué)變化 倒置相差顯微鏡觀察，正義組細胞及不加藥組細胞生長良好，貼壁生長，細胞間結(jié)構(gòu)緊密，輪廓清楚，細胞呈梭型，胞漿內(nèi)顆粒較少，細胞核隱約可見，細胞生長旺盛。而反義組細胞有部分變圓浮起，細胞接觸變松，細胞界限模糊，細胞顆粒較多，漂浮細胞數(shù)量增加，增殖減慢。經(jīng)Giemsa染色后顯微鏡下見正義組與空白組細胞形態(tài)飽滿，細胞核染色均勻，核仁清晰可見;而反義組細胞中出現(xiàn)細胞質(zhì)濃縮，變圓，核染色不均勻，核物質(zhì)邊聚成新月形或塊壯，未見大量的凋亡小體。說明反義組細胞出現(xiàn)了凋亡的形態(tài)學(xué)改變。見圖1、2。

2.2 DNA Ladder檢測 從瓊脂糖凝膠電泳可觀察到隨著hTERT反義寡核苷酸濃度的增加 DNA梯狀條帶也越來越明顯。而正義組與空白組無DNA梯度圖形的出現(xiàn)。這是由于細胞凋亡時鈣離子內(nèi)流，激活核酸性內(nèi)切酶DNA被切割成最小180～200個堿基片段染色質(zhì)DNA片斷絕大部分發(fā)生于核小體的連接部位，所形成DNA片斷的大小為180～200堿基對的倍數(shù)。經(jīng)電泳形成梯狀帶。說明hTERT反義寡核苷酸作用的內(nèi)膜癌細胞引起了凋亡。見圖3。

圖1 正義寡核苷酸組ishikawa細胞無凋亡細胞存在(Gimusa×400)

圖2 反義核苷酸組ishikawa細胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)變化(Gimusa×400)

圖3 不同濃度反義寡核苷酸與正義組、空白對照組DNA電泳帶結(jié)果

2.3 流式細胞儀檢測細胞Bcl-2蛋白表達情況 在細胞凋亡過程中有多種癌基因和胞內(nèi)信使參與調(diào)節(jié)。Bcl-2基因族所起的作用愈來愈受到重視。Bcl-2基因是一種廣泛性的抗凋亡基因，可抑制許多因素引起的細胞凋亡，可導(dǎo)致各種癌癥的發(fā)生。細胞凋亡中DNA的消化需要相關(guān)的核酸性內(nèi)切酶的參與，而bcl-2基因可以阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋出，使依賴于Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低，從而阻斷細胞凋亡。

用流式細胞儀檢測到不同濃度的反義核苷酸作用于子宮內(nèi)膜癌細胞48 h后出現(xiàn)了一群亞G1期細胞即凋亡細胞，圖中可見到凋亡峰的出現(xiàn)，而正義組與空白組無凋亡改變。隨反義核苷酸作用濃度的增加細胞凋亡率越來越高，不同濃度之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。而正義組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，進一步用流式細胞儀分析細胞周期發(fā)現(xiàn)hTERT反義核苷酸對細胞周期有明顯影響，與正義組和空白組相比，反義組細胞G0～G1期細胞增多，S期細胞和G2-M期細胞減少(P＜0.01)并呈濃度依賴性，增殖指數(shù)在同一作用濃度，反義組與正義組和空白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，不同作用濃度，反義組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而正義組與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明hTERT反義核苷酸明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細胞ishikawa增殖。見圖4。

圖4 流式細胞儀檢測不同濃度反義核苷酸

3 討論

端粒酶(Telomerase)是一種以自身RNA為模板，將端粒DNA合成至染色體末端的核糖核蛋白復(fù)合物 (ribonucleoprotein，RNP)。端粒酶的主要組分為:(1)端粒酶催化亞單位(TERT)。(2)RNA分子或端粒酶RNA(TR)，它包含了添加端粒酶重復(fù)結(jié)構(gòu)的模板區(qū)。人類hTR已被克隆。(3)大量的端粒酶相關(guān)蛋白。蛋白質(zhì)組分鑒定進展緩慢。Sharma等［3］用維甲酸(RA)，VitD3，丁酸鈉等細胞分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細胞分化表明:隨著細胞分化程度的增加，端粒酶活性隨之降低。人端粒酶催化亞單位(hTERT)是一個最近才被克隆出來的單拷貝基因，其基因組含有逆轉(zhuǎn)錄酶催化區(qū)域高度保守的特異序列?，F(xiàn)已證明hTERTmRNA只在惡性腫瘤組織或腫瘤細胞株以及某些有高度再生潛力的自我更新組織(如子宮內(nèi)膜)中表達，與端粒酶活性表達一致，對癌病變特異，其上游調(diào)節(jié)對端粒酶活性表達起重要作用，被認為是端粒酶活性的限速決定因素。反義寡核苷酸的作用機制，目前還未完全明確。ASONs的作用機制與其骨架結(jié)構(gòu)有關(guān):(1)帶有負電荷的ODNs與互補mRNA結(jié)合后可以激活非特異性核糖核酸酶— RNaseH后者切割RNA DNA雜化雙鏈中mRNA鏈，抑制其表達。(2)其他不帶負電荷的ASONsA通過空間位阻效應(yīng)發(fā)揮作用。應(yīng)用ASONs抑制特定基因表達時首先要解決寡核苷酸的穩(wěn)定性問題。因為寡核苷酸在生物學(xué)介質(zhì)中很容易被廣泛存在的核酸酶降解。為解決這一問題，許多化學(xué)修飾的核苷酸被引入到AS-ONS中，包括磷酸骨架的改變，戊糖的修飾(主要在核糖的2，羥基)等等。例如硫代寡核苷酸(PSODNs)等大大提高了寡核苷酸抗核酸酶降解的能力。PSODN具有良好的水溶性、穩(wěn)定性及易于大量合成，基本能滿足臨床治療的需要。與天然 ODN相比，PSODN通過細胞內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)平衡所需時間更長，最終細胞內(nèi)濃度也更高;其t1/2一般都大于24 h，極大地提高了對核酸酶的耐受能力。本實驗就采用了對寡核苷酸的全硫代修飾。

從瓊脂糖凝膠電泳可觀察到隨著hTERT反義寡核苷酸濃度的增加DNA梯狀條帶也越來越明顯。而正義組與空白組無DNA梯度圖形的出現(xiàn)。這是由于細胞凋亡時鈣離子內(nèi)流，激活核酸性內(nèi)切酶DNA被切割成最小180～200個堿基片段染色質(zhì)DNA片斷絕大部分發(fā)生于核小體的連接部位，所形成DNA片斷的大小為180～200堿基對的倍數(shù)。經(jīng)電泳形成梯狀帶。說明hTERT反義寡核苷酸作用的內(nèi)膜癌細胞引起了凋亡。目前，研究凋亡最敏感的方法是流式細胞儀檢測。用FCM檢測細胞凋亡率與細胞周期發(fā)現(xiàn)反義核苷酸作用于內(nèi)膜癌細胞48 h后可測到凋亡峰，隨濃度的增加凋亡率增加最大凋亡率 。細胞凋亡時形成的DNA堿基片段于G1期前形成的亞峰，即凋亡峰。而正義組與空白組未見明顯的凋亡峰。細胞周期是細胞生長、分裂時，依次經(jīng)過G1、S、G2、M期，一分為二，周而復(fù)始的過程，稱之為細胞分裂周期(cell divide cycle)。根據(jù)細胞內(nèi)DNA含量的變化可將增值周期分為4期。FCM結(jié)果表明反義組細胞G0-G1期細胞增多，S期和G2-M期細胞減少，增殖指數(shù)也隨之減少，并呈濃度依賴性。與正義組和空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。正義組和空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。Zhao等［4］發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞被阻滯于S期時其端粒酶活性最高，實驗證明hTERT反義寡核苷酸在細胞進入DNA合成期前引起DNA損傷，使細胞停滯在G0～G1期，并誘導(dǎo)細胞凋亡。

在細胞凋亡過程中有多種癌基因和胞內(nèi)信使參與調(diào)節(jié)，Bcl-2基因族所起的作用愈來愈受到重視。Bcl-2基因是一種廣泛性的抗凋亡基因，可抑制許多因素引起的細胞凋亡，可導(dǎo)致各種癌癥的發(fā)生。細胞凋亡中DNA的消化需要相關(guān)的核酸性內(nèi)切酶的參與，而Bcl-2基因可以阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋出，使依賴于Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低，從而阻斷細胞凋亡。Bermudez［5］的研究顯示，端粒酶的激活能夠抑制 caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性，下調(diào)促凋亡蛋白t-BID、BAD、BAX的表達，上調(diào)抗凋亡線粒體蛋白bcl-2的表達，從而抑制caspase介導(dǎo)的細胞凋亡。端粒酶活性與細胞增殖有關(guān)，因此，端粒酶抑制劑抑制了細胞端粒酶活性，自然也使其增殖受到抑制。本實驗結(jié)果也證實，端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸抑制端粒酶活性，同時也抑制了細胞增殖。

Shammas等［6］的研究顯示，針對端粒酶RNA的反義寡核苷酸GRN163L能夠抑制骨髓細胞的端粒酶活性，并引起細胞凋亡。另有研究結(jié)果表明，端粒酶活性與細胞增殖有關(guān)，因此，端粒酶抑制劑抑制了細胞端粒酶活性，自然也使其增殖受到抑制［7］。本實驗結(jié)果也證實，端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸抑制端粒酶活性，同時也抑制了細胞增殖。本實驗表明反義寡核苷酸能誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡，抑制端粒酶活性，抑制端粒酶合成端粒，從而抑制胃癌細胞的生長，說明端粒酶反義寡聚脫氧核苷酸能有效地抑制腫瘤細胞的生長，為抗端粒酶的腫瘤基因治療提供了實驗基礎(chǔ)。絕大多數(shù)正常體細胞缺乏端粒酶活性，應(yīng)用此藥物，可避免治療的不良反應(yīng)，增強治療的特異性。今后應(yīng)進一步探索抗端粒酶藥物的作用機制，使高效抑制劑早日用于臨床。

1 王紅軍，于洪濤，陳瓊.端粒酶RNA的反義寡核苷酸抑制裸鼠移植瘤生長的研究.中國肺癌雜志，2008，11:198-201.

2 曾益新主編.腫瘤學(xué).第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2001.242.

3 Walton SP，Stephanopoulos GN，Yarmush ML，et al.Thermodynamic and kinetic-characterization of oligodexynucleotide binding to a structured mRNA.J Biophys，2002，82:366-377.

4 Zhao YM，Li JY，Lan JP，et al.Cell cycle dependent te-lomere regulation by telomerase in human bone marrow mesenchymal stem cells.Biochem Biophys Res Commun，2008，369:1114-1119.

5 Bermudez Y，Grasso D，John NC，et al.Telomerase con-fers resistance to caspase-mediated apoptosis.Clin Inter Aging，2006，1:155-167.

6 Shammas MA，Koley H，Bertheau RC，et al.Telomerase inhibitor GRN163L inhibits myeloma cell growth in vitro and invivo.Leukemia，2008，22:1410-1418.

7 Chen Z，Koeneman KS，Corey DR.Consequences of telomerase in-hibition and combination treatments for the proliferation of cancer cells.Cancer Res，2005，63:5917-5925.

Effect of telomerase antisense oligodeoxynucleotide on endometrial carcinoma cell strain

YANG Rongjuan，XU Yanlei，LIU Xueqin，et al.The Fourth Hospital of Shijiazhuang City，Shijiazhuang050011，China

ObjectiveTo observe the effect of telomerase antisense oligodeoxynucleotide on endometrial carcinoma cell strain.MethodsAfter endometrial carcinoma cell strain was incubated with telomerase antisense oligodeoxynucleotide for a certain time，the changes of cell morphous were observed，and the expression levels of bcl-2 protein and telomerase＇s activity were detected.ResultsTelomerase antisense oligodeoxynucleotide could induce the apoptosis of endometrial carcinoma cells and could inhibit telomerase activity.The observation for cell morphous showed that cells became round shape，cytoplasm was condensed，without uniform nuclear staining，with crescent or lump form nuclear matter as well as the apoptosis characteristic Ladder bands showed by electrophoresis.Flow cytometry analysis revealed that antisense oligodeoxynucleotide could cause DNA damage before the cells were differentiated into DNA synthesis period，as a result，which resulted in the stagnation of cells at G0-G1 phase，and induced cell apoptosis.ConclusionTelomerase antisense oligodeoxynucleotide can inhibit telomerase＇s activity and can induce the apoptosis of endometrial carcinoma cell，as a result，which can inhibit the proliferation of endometrial carcinoma cell.

telomerase;endometrial carcinoma cells;antisense oligodeoxynucleotide;apoptosis

R 711.7

A

1002－7386(2012)17－2576－04

10.3969/j.issn.1002－7386.2012.17.006

050011 河北省石家莊市第四醫(yī)院

2012－02－01)