林小梅， 莫娟梅， 鄒 敏， 曾愛屏， 于起濤， 周韶璋， 宋向群△

(廣西醫(yī)科大學(xué)1研究生院，2附屬腫瘤醫(yī)院化療二科，廣西 南寧530021)

肺癌是世界上癌癥死亡的常見惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(non－small－cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的80%～85%［1］，其中晚期NSCLC 患者的5 年生存率只有約15%，目前在晚期NSCLC 的治療上，一線含鉑的兩藥化療方案只使患者獲得了8 ～11 個(gè)月的中位生存期，其療效非常有限。隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制及其生物學(xué)行為研究的不斷深入，人們?cè)絹碓蕉鄬⒅委煹慕裹c(diǎn)集中于特異性高、不良反應(yīng)輕的分子靶向藥物。目前NSCLC 的治療使用最多的是針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變的分子靶向藥物，即小分子的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKIs)，其對(duì)存在EGFR 突變的NSCLC 患者顯示出了很好的臨床療效［2］。目前已證實(shí)其突變的優(yōu)勢(shì)人群具有以下的臨床特征:女性、不吸煙、亞裔和腺癌［3－4］。但在使用TKIs 過程中導(dǎo)致的原發(fā)或繼發(fā)耐藥尚難克服，因而對(duì)于不能從EGFR－TKIs 治療中獲益或發(fā)生耐藥的人群來說，尋找新的治療靶標(biāo)將顯得尤為重要。

2007 年Soda 等［5］首次在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型的融合基因EML4－ALK，此融合基因由棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4(echinoderm microtubule－associated protein－like 4，EML4)和間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)兩者的部分基因相互融合而成。EML4－ALK 在不加選擇的NSCLC 患者中的總表達(dá)率為3.4%［6］;而在某些經(jīng)過篩選的NSCLC 人群中，EML4－ALK 的表達(dá)率可高達(dá)13.5%［7］。由于EML4－ALK 融合位點(diǎn)的多樣性，目前至少發(fā)現(xiàn)11 種不同的突變體類型［8］。且EML4－ALK 無論在體外或體內(nèi)的研究中均具有致癌活性［5，9］，這種活性能被ALK 抑制劑有效阻斷［9－10］，說明其在肺癌的發(fā)生過程中起著關(guān)鍵性的作用。

在中國(guó)NSCLC 人群中，有研究示EML4－ALK 的表達(dá)率為2.9% ～11.6%［11－14］，但相關(guān)研究仍然非常有限，且進(jìn)行EML4－ALK 檢測(cè)的NSCLC 患者例數(shù)仍較少。故為豐富中國(guó)肺癌分子缺陷目錄數(shù)據(jù)庫(kù)，本文對(duì)102 例經(jīng)過選擇的中國(guó)非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行EML4－ALK 融合基因檢測(cè)，同時(shí)對(duì)檢測(cè)EML4－ALK 融合基因陽性患者的EGFR 和Kirsten 鼠肉瘤基因(Kirsten rat sarcoma，KRAS)的突變情況，并對(duì)EML4－ALK陽性和陰性病人的臨床及病理特征進(jìn)行分析。為今后篩選EML4－ALK 突變的潛在臨床優(yōu)勢(shì)人群及實(shí)現(xiàn)以基因分型為基礎(chǔ)的NSCLC 個(gè)體化治療提供理論依據(jù)和重要的參考。

材 料 和 方 法

1 標(biāo)本來源

入選實(shí)驗(yàn)的102 例非小細(xì)胞肺癌患者均為中國(guó)人，且必須滿足以下至少一個(gè)條件(女性、不吸煙/少吸煙和腺癌)，病人的組織標(biāo)本均來自中國(guó)廣西壯族自治區(qū)腫瘤醫(yī)院的標(biāo)本庫(kù)，為2006 年1 月～2011 年8 月期間在廣西壯族自治區(qū)腫瘤醫(yī)院胸外科接受手術(shù)切除的腫瘤組織標(biāo)本。腫瘤組織經(jīng)手術(shù)切除后馬上浸泡于液氮中，隨后保存于－80 ℃冰箱中。

2 病人的臨床及病理信息的收集

入選實(shí)驗(yàn)的102 例患者，均收集其以下信息:年齡、性別、吸煙史、組織病理分型及臨床分期，見表1。病人的組織病理分型參考2004 版世界衛(wèi)生組織(WHO)的肺癌組織學(xué)分類［15］，臨床分期參考第6 版國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)(IASLC)的肺癌TNM 分期。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

3 主要試劑

RNA 提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)為Qiagen 產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit)為Fermentas 產(chǎn)品;DNA 聚合酶(KOD plus DNA polymerase )為Toyobo 產(chǎn)品;DNA 提取試劑盒(SK1261)和TaqDNA 聚合酶均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司;所用引物由寶生物工程(大連)有限公司根據(jù)要求合成。

4 主要方法

4.1 EML4－ALK 的檢測(cè) 首先使用RNA 提取試劑盒提取102 例非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本的總RNA，具體提取步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。所有提取的總RNA 均經(jīng)超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific NanoDrop 2000)檢測(cè)其濃度及純度，其中所有標(biāo)本的總RNA 的A260/A280均為2.0 ～2.1 之間，且經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA 的完整性。提取的總RNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，逆轉(zhuǎn)錄步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。單鏈cDNA 經(jīng)單管多重反轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈鎖反應(yīng)(multiplex RT－PCR)進(jìn)行擴(kuò)增。因?yàn)槟壳耙阎狤ML4－ALK 有11種不同的突變體類型(8)［7］，為了用cDNA 擴(kuò)增出所有已知的突變亞型，本實(shí)驗(yàn)中單管PCR 反應(yīng)同時(shí)使用了3 對(duì)不同的引物［11］，見表1。PCR 總反應(yīng)體積25 μL，其中10 × buffer 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5μL，25mmol/L MgSO4 1μL，上游引物(10 μmol/L)各加入1μL，下游引物(10 μmol/L)3μL，Template cDNA 1μL，PCR grade water 12.3 μL，KOD－Plus 0.7 μL。擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，68 ℃1 min ，共35 個(gè)循環(huán)，68 ℃10 min。同時(shí)PCR 反應(yīng)設(shè)置內(nèi)參照為甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)，其PCR 反應(yīng)引物見表1。內(nèi)參照擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃30 s，58 ℃30 s，72℃45 s ，共35 個(gè)循環(huán)，72 ℃3 min。取RT－PCR 產(chǎn)物8.0 μL，加上樣緩沖液2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，90 V 40 min，凝膠圖像分析系統(tǒng)(GelPro Analyzer 3.0)分析目的基因與內(nèi)參照GAPDH 條帶顯示，對(duì)于顯現(xiàn)目的基因條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司直接測(cè)序。

4.2 EGFR 和KRAS 的檢測(cè) 本文對(duì)8 例EML4－ALK 融合基因陽性的患者腫瘤組織標(biāo)本分別檢測(cè)其EGFR(18 ～21 外顯子)和KRAS(1、2 外顯子)的突變情況。首先使用DNA 提取試劑盒提取8 例陽性標(biāo)本的DNA，后使用各個(gè)外顯子的相應(yīng)引物對(duì)DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物直接送上海生工生物工程公司直接測(cè)序。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用連續(xù)校正χ2檢驗(yàn)(continuity correction χ2Test)和Fisher 精確概率法(Fisher’s exact test)來分析EML4－ALK 陽性和陰性病人與年齡、性別、吸煙史、病理類型及臨床分期之間的聯(lián)系。所有P 值均基于雙向假設(shè)檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 13.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

結(jié) 果

1 EML4－ALK 的突變率及其與臨床病理特征之間的聯(lián)系

在102 例經(jīng)過選擇的非小細(xì)胞肺癌患者中檢測(cè)出8 例EML4－ALK 陽性，其突變率為7.8%(8/102)。將8 例陽性患者腫瘤組織標(biāo)本的PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序，其中7 例為EML4－ALK 突變亞型1(variant 1，V1)，1 例為EML4－ALK 突變亞型2(variant 2，V2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出EML4－ALK 陽性和陰性患者在年齡(P ＞0.05)、性別(P ＞0.05)、吸煙史(P ＞0.05)、病理類型(P ＞0.05)及臨床分期(P ＞0.05)差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1、2、表2。

2 EML4－ALK 陽性患者在臨床病理特征中的構(gòu)成比

102 例患者的總體平均年齡為(59 ±10)歲(30 ～80 歲)，8 例EML4－ALK 陽性患者平均年齡(59 ±5)歲(41 ～80 歲)。在8 例陽性患者中，有5 例患者的年齡小于總體患者的平均年齡，占62.5%(5/8)，3 例患者的年齡大于總體患者的平均年齡，占37.5%(3/8)。女性6 例，占75.0%(6/8);男性2例，占25.0%(2/8)。在吸煙史中，7 例患者不吸煙，占87.5%(7/8);1 例患者吸煙，占12.5%(1/8)。在病理類型中，5例為腺癌，占62.5%(5/8);1 例為鱗癌，占12.5%(1/8);2例為腺鱗癌，占25.0%(2/8)。在臨床分期中，4 例患者為Ⅰ期，占50.0%(4/8);3 例患者為Ⅲ期，占37.5%(3/8);1 例為Ⅳ期，占12.5%(1/8)，見表2。

Figure 1. The RT－PCR results of 8 EML4－ALK positive cases.M:maker(100 bp，ladder);NTC:non－template control;24，34，…，90:the number of the positive sample.V1:EML4－ALK variant 1(237 bp);V2:EML4－ALK variant 2(960 bp);GAPDH:glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase.圖1 8 例陽性標(biāo)本的RT－PCR 產(chǎn)物

Figure 2. Base sequencing figures of positive samples. A:EML4－ALK variant 1;B:EML4－ALK variant 2.圖2 陽性標(biāo)本的堿基測(cè)序圖

表2 病人臨床病理特征及EML4－ALK 陽性與陰性病人的臨床病理特征的對(duì)比Table 2. A summary of all patients with clinicopathological features and the comparison of clinicopathological features between the EML4－ALK－positive and－negative patients

3 EML4－ALK 陽性病人的EGFR 和KRAS 突變情況

經(jīng)過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，8 例EML4－ALK 融合基因陽性的患者均無EGFR(18 ～21 外顯子)及KRAS(1、2 外顯子)的突變。

討 論

自從2007 年Soda 等［5］首次在NSCLC 患者身上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的EML4－ALK 融合基因后，陸續(xù)有許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了研究。對(duì)于EML4－ALK 在非小細(xì)胞肺癌中的突變率，不同文獻(xiàn)的報(bào)道稍有差異。楊衿記等［6］綜合全球17 個(gè)研究的數(shù)據(jù)得出，EML4－ALK 在不加選擇的NSCLC 患者中的總表達(dá)率為3.4%，其中東方人NSCLC 患者為4.1%，而高加索人NSCLC 患者為2.5%。這些大規(guī)模非選擇NSCLC 患者的系列研究提示東西方人種EML4－ALK 融合基因總發(fā)生率似乎相似。但某些研究中進(jìn)行EML4－ALK 檢測(cè)的NSCLC 患者是經(jīng)過篩選的，如Shaw 等［7］研究中入組的患者必須滿足以下至少2 個(gè)條件(女性、亞裔、不吸煙/少吸煙和腺癌)，故在富含上述因子的NSCLC 人群中得出了EML4－ALK 的突變率為13.5%(19/141)。而Sun 等［11］通過篩選東亞不吸煙的肺腺癌患者作為研究對(duì)象后，得出EML4－ALK 的突變率5.8%(3/52)。似乎經(jīng)過篩選的NSCLC 患者其EML4－ALK 突變率較不加選擇的NSCLC 患者的突變率稍高(13.5%或5.8% vs 3.4%)。在本研究中同樣限定實(shí)驗(yàn)對(duì)象必須滿足以下至少一個(gè)條件(女性、不吸煙/少吸煙、腺癌)，同時(shí)研究中所有患者均為亞裔，經(jīng)檢測(cè)后我們得出EML4－ALK 的突變率7.8%(8/102)，我們的結(jié)果同樣比不加選擇的NSCLC 患者的總突變率稍高(7.8% vs 3. 4%)，但低于Shaw 等的研究結(jié)果(7.8% vs 13.5%)。這可能與我們篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)象的條件與Shaw 等的研究并非完全一致有關(guān)，亦可能不同種族(亞裔vs高加索人)之間EML4－ALK 的突變率存在差異。故EML4－ALK 融合基因突變率在不同地域和種族中是否存在差異?仍需要更多的研究來證實(shí)。

在Sasaki 等［8］的綜述中顯示，在各種突變類型中，最常見的類型為突變體1 型(E13－A20，V1)，檢出率高達(dá)33%。而在本文8 例EML4－ALK 陽性患者中，7 例為V1，1 例為V2，V1 亞型占所有陽性標(biāo)本的87.5%(7/8)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似。

之前有文獻(xiàn)報(bào)道，EML4－ALK 陽性多見于年輕［7，12，16］，不吸煙/少吸煙［7，10，12，16］，腺癌［10，17－19］的非小細(xì)胞肺癌患者。我們通過比較EML4－ALK 陽性和陰性病人的臨床及病理特征得出，陽性和陰性病人在年齡、性別)、吸煙史、病理類型及臨床分期方面的差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因可能是由于我們實(shí)驗(yàn)入組的研究對(duì)象是經(jīng)過篩選的人群(其中女性、不吸煙/少吸煙、腺癌這3 個(gè)條件必須滿足至少1 個(gè))，如表1 所示，使得入組的患者接近一半為女性(47.1%)，且大多數(shù)偏向于不吸煙(71.6%)、腺癌(71.6%)的患者，這就造成我們?nèi)虢M人群的選擇偏倚。故最后再分析陽性和陰性病人在性別、吸煙史及病理類型方面的差別時(shí)，就得到了差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

但本研究8 例EML4－ALK 陽性患者的臨床特征構(gòu)成比顯示(表1):8 例陽性患者中，有5 例患者的年齡低于總體患者的平均年齡(62.5%)，3 例患者的年齡高于總體患者的平均年齡(37.5%)，說明EML4－ALK 陽性更多見于年輕患者。雖然女性是我們選擇入組的條件之一，但是從基線上看男女比例分別為52.9%和47.1%，基本平衡。但我們的結(jié)果提示在8 例陽性患者中，6 例為女性，2 例為男性(75% vs 25%)，女性為男性的3 倍。故在男女入組比例基本平衡的情況下，EML4－ALK 陽性更多見于女性患者。由于亞裔女性的吸煙率較低，在本研究中女性患者的吸煙率僅為6.3%(3/48)，且本研究中75%的EML4－ALK 陽性患者為女性，這一點(diǎn)也能解析為什么EML4－ALK 陽性更多見于不吸煙的人群。另外，我們發(fā)現(xiàn)8 例EML4－ALK 陽性患者中，5 例為腺癌，占62.5%(5/8)，這與之前絕大多數(shù)研究結(jié)果顯示EML4－ALK 陽性多見于腺癌患者相似［10，17－19］。另外2 例為腺鱗癌，亦含有腺癌的成分，說明EML4－ALK 陽性更多見于腺癌患者。

本文中8 例EML4－ALK 融合基因陽性患者的EGFR 和KRAS 突變狀態(tài)均為野生型。這與之前的絕大多數(shù)報(bào)道相符［5，7，12，16，19］，似乎說明了EML4－ALK、EGFR 和KRAS 這三者之間是相互排斥的。但是也存在特殊的病例，在Koivunen等［10］的報(bào)道中，在一個(gè)日本的腺癌病人身上同時(shí)發(fā)現(xiàn)了EML4－ALK 和EGFR 的突變;在中國(guó)NSCLC 人群中，Zhang等［13］也報(bào)道了在一個(gè)女性腺癌病人身上存在著EGFR 19 號(hào)外顯子和EML4－ALK 的雙重突變;Martelli 等［17］也在一個(gè)54歲的男性肺腺癌患者身上發(fā)現(xiàn)了EML4－ALK 和KRAS 的同時(shí)突變;目前認(rèn)為以上共同突變屬于罕見事件。故EGFR 和KRAS 野生型與EML4－ALK 突變是同一分子事件的必然結(jié)果，還是純屬不同分子事件的巧合呢?以上問題還需在更廣泛的人群(包括不同種族、年齡、性別、病理類型和疾病的不同階段)中檢測(cè)除EML4－ALK 以外的更多分子指標(biāo)，以發(fā)現(xiàn)和揭示這些不同分子事件的本質(zhì)和彼此間的關(guān)聯(lián)。同時(shí)有研究［20］發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)EGFR 的表達(dá)程度對(duì)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移均存在密切的影響，那么EML4－ALK 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)程度是否對(duì)NSCLC 的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移存在影響?這也仍需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

EML4－ALK 融合基因已經(jīng)代表了非小細(xì)胞肺癌的一種新的亞型，針對(duì)其的靶向藥物的臨床研究正在進(jìn)行，所以我們應(yīng)該堅(jiān)信，在倡導(dǎo)腫瘤個(gè)體化治療的今天，針對(duì)EML4－ALK 這一靶點(diǎn)的深入研究，將有助于對(duì)其優(yōu)勢(shì)人群的正確篩選并開創(chuàng)ALK 抑制劑的非小細(xì)胞肺癌靶向治療新領(lǐng)域，同時(shí)將促使肺癌個(gè)體化治療更加精準(zhǔn)有效和逐步走向成熟。

［1］ Molina JR，Yang P，Cassivi SD，et al. Non－small cell lung cancer:epidemiology，risk factors，treatment，and survivorship［J］. Mayo Clin Proc，2008，83(5):584－594.

［2］ Lynch TJ，Bell DW，Sordella R，et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non－small－cell lung cancer to gefitinib［J］. N Engl J Med，2004，350(21):2129－2139.

［3］ Paez JG，Janne PA，Lee JC，et al. EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinib therapy［J］. Science，2004，304(5676):1497－1500.

［4］ Shigematsu H，Lin L，Takahashi T，et al. Clinical and biological features associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers［J］. J Natl Cancer Inst，2005，97(5):339－346.

［5］ Soda M，Choi YL，Enomoto M，et al. Identification of the transforming EML4－ALK fusion gene in non－small－cell lung cancer［J］. Nature，2007，448(7153):561－566.

［6］ 楊衿記，張緒超，江本元，等. EML4－ALK 融合基因?yàn)榘悬c(diǎn)的晚期NSCLC 個(gè)體化治療研究進(jìn)展［J］. 癌癥進(jìn)展，2010，8(6):538－545.

［7］ Shaw AT，Yeap BY，Mino－Kenudson M，et al. Clinical features and outcome of patients with non－small－cell lung cancer who harbor EML4－ALK［J］. J Clin Oncol，2009，27(26):4247－4253.

［8］ Sasaki T，Rodig SJ，Chirieac LR，et al. The biology and treatment of EML4－ALK non－small cell lung cancer［J］.Eur J Cancer，2010，46(10):1773－1780.

［9］ Soda M，Takada S，Takeuchi K，et al. A mouse model for EML4－ALK－positive lung cancer［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105(50):19893－19897.

［10］ Koivunen JP，Mermel C，Zejnullahu K，et al. EML4－ALK fusion gene and efficacy of an ALK kinase inhibitor in lung cancer［J］. Clin Cancer Res，2008，14(13):4275－4283.

［11］ Sun Y，Ren Y，F(xiàn)ang Z，et al. Lung adenocarcinoma from East Asian never－smokers is a disease largely defined by targetable oncogenic mutant kinases［J］. J Clin Oncol，2010，28(30):4616－4620.

［12］ Wong DW，Leung EL，So KK，et al. The EML4－ALK fusion gene is involved in various histologic types of lung cancers from nonsmokers with wild－type EGFR and KRAS［J］. Cancer，2009，115(8):1723－1733.

［13］ Zhang X，Zhang S，Yang X，et al. Fusion of EML4 and ALK is associated with development of lung adenocarcinomas lacking EGFR and KRAS mutations and is correlated with ALK expression［J］. Mol Cancer，2010，9:188.

［14］ Rikova K，Guo A，Zeng Q，et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer［J］. Cell，2007，131(6):1190－1203.

［15］ Beasley MB，Brambilla E，Travis WD. The 2004 World Health Organization classification of lung tumors［J］. Semin Roentgenol，2005，40(2):90－97.

［16］ Inamura K，Takeuchi K，Togashi Y，et al. EML4－ALK fusion is linked to histological characteristics in a subset of lung cancers［J］. J Thorac Oncol，2008，3(1):13－17.

［17］ Martelli MP，Sozzi G，Hernandez L，et al. EML4－ALK rearrangement in non－small cell lung cancer and non－tumor lung tissues［J］. Am J Pathol，2009，174(2):661－670.

［18］ Takeuchi K，Choi YL，Soda M，et al. Multiplex reverse transcription－PCR screening for EML4－ALK fusion transcripts［J］. Clin Cancer Res，2008，14(20):6618－6624.

［19］ Shinmura K，Kageyama S，Tao H，et al. EML4－ALK fusion transcripts，but no NPM－，TPM3－，CLTC－，ATIC－，or TFG－ALK ffusion transcripts，in non－small cell lung carcinomas［J］. Lung Cancer，2008，61(2):163－169.

［20］ 鐘雪云，肖柳珍，廖劍輝，等.上皮生長(zhǎng)因子受體與非小細(xì)胞肺癌腫瘤免疫及轉(zhuǎn)移的相關(guān)關(guān)系［J］. 中國(guó)病理生理雜志，1999，15(6):506－508.