劉天德， 余 新， 袁榮發(fā)， 王慶諾， 楊志強(qiáng)， 邵江華，2△

(1南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，2江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330006)

Rho 相關(guān)含卷曲螺旋蛋白激酶(Rho－associated coiled－coil－containing protein kinase，Rock)是新近發(fā)現(xiàn)的Rho/Rock 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，包括Rock1 和Rock2 亞單位［1］，其具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種行為和功能，并與腫瘤惡性程度、腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞的黏附、收縮、遷移和胞漿的分裂有關(guān)［2－3］。研究表明，Rock2 在肝癌等惡性腫瘤中表達(dá)水平異常增高［4］。我們的前期研究表明，降低肝癌細(xì)胞中Rock2 蛋白表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并使細(xì)胞周期阻滯在G1/S 期。細(xì)胞分裂周期蛋白25A(cell division cycle 25A，Cdc25A)是控制G1/S期調(diào)節(jié)途徑的重要檢查點(diǎn)蛋白，在轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)激活作用中是一個(gè)重要的效應(yīng)分子［5］。也有研究表明，Cdc25A 在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)［6］。但Rock2 與Cdc25A 蛋白之間是否存在關(guān)聯(lián)，目前尚不清楚，本研究擬探討Rock2 對(duì)Cdc25A 蛋白的調(diào)節(jié)作用。

材 料 和 方 法

1 材料

DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(HyClone)，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen)，羊抗多克隆Rock2Ⅰ抗(Santa Cruz)，兔抗多克隆Cdc25A Ⅰ抗(Santa Cruz)，兔抗多克隆檢查點(diǎn)激酶(checkpoint kinase，Chk)1Ⅰ抗(Santa Cruz)，兔抗多克隆Chk2Ⅰ抗(Santa Cruz)，Protein A/G PLUS－Agarose(Santa Cruz)。DNA 切膠回收試劑盒、質(zhì)粒大量提取及小量提取試劑盒(北京天根公司)。設(shè)計(jì)的Rock2 干擾序列及相關(guān)引物由上海生工合成。pcDNA5－FRT－6×his－Rock2 質(zhì)粒及pCMV－N－HA－Cdc25A 質(zhì)粒已于前期構(gòu)建，人肝細(xì)胞性肝癌細(xì)胞株Huh－7 和HepG2 由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 標(biāo)本

收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科2009 年1月～2010 年7 月肝癌及癌旁組織標(biāo)本，共計(jì)51 例，收集后立即液氮保存。經(jīng)病理切片證實(shí)均為原發(fā)性肝癌標(biāo)本。

3 細(xì)胞株的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

Huh－7 和HepG2 細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。按脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染6 h 后更換為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基。

4 MTT 法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖

在離心管內(nèi)將各組細(xì)胞懸液充分打勻，按8 ×103cells/well 接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔加液量200 μL，24 h 后換液，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后1 ～4 d每孔加入5 g/L MTT 試劑20 μL，于37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育4 h。吸取各孔上清，加入DMSO 150 μL/well，室溫下置水平搖床搖10 min 以充分溶解MTT 結(jié)晶。在酶聯(lián)免疫測(cè)定儀上選擇波長(zhǎng)490 nm，空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光度(A)值。每組重復(fù)3 次。細(xì)胞增長(zhǎng)率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均A490/對(duì)照組平均A490)×100%。

5 shRock2 干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選

根據(jù)NCBI 上查到的人Rock2 mRNA 序列(NM_004850.3)，設(shè)計(jì)4 對(duì)寡聚單鏈DNA，連接到pcDNATM6.2－GW/EmGFPmiR 載體中，測(cè)序驗(yàn)證，見表1。將4 個(gè)shRock2 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞Huh－7 中，48 h 后提取總蛋白，Western blotting 分析Rock2 蛋白的表達(dá)，篩選出干擾效果最佳的shRock2質(zhì)粒。

表1 miRNA 寡聚單鏈DNA 序列Table 1. Oligomeric single－stranded DNA sequences

6 篩選Rock2 穩(wěn)定低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株

將上述篩選出的最佳shRock2 干擾質(zhì)粒利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞Huh－7和HepG2 中，轉(zhuǎn)染48 h 后加入殺稻瘟素(blasticidin)篩選，濃度為10 mg/L。48 h 后加入5 mg/L 殺稻瘟素繼續(xù)培養(yǎng)3 周，Western blotting 檢測(cè)Rock2 蛋白的變化，篩選出Rock2 穩(wěn)定低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株。

7 檢測(cè)Rock2 穩(wěn)定低表達(dá)肝癌細(xì)胞中Cdc25A、Chk1 和Chk2 蛋白的變化

提取各組肝癌細(xì)胞的總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，取等量50 μg 蛋白質(zhì)樣品煮沸5 min 后行10%SDS－PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)，然后分別結(jié)合對(duì)應(yīng)Cdc25A、Chk1、Chk2Ⅰ抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，應(yīng)用ECL 發(fā)光試劑顯示蛋白質(zhì)條帶，暗室曝光。每組實(shí)驗(yàn)共平行進(jìn)行3 次。

8 Rock2 突變質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

為消除RNA 干擾技術(shù)中的脫靶效應(yīng)，我們針對(duì)Rock2 干擾序列進(jìn)行了堿基定點(diǎn)突變，見表2。以pcDNA5－FRT－6 × his－Rock2 質(zhì)粒為模板，構(gòu)建Rock2 突變質(zhì)粒(經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證)以此“恢復(fù)”Rock2 蛋白的表達(dá)，Western blotting 檢測(cè)Rock2 和Cdc25A 蛋白的變化及MTT 法觀察肝癌細(xì)胞增殖的變化。

表2 Rock2 定點(diǎn)突變引物Table 2. Site－directed mutagenesis primers of Rock2

9 免疫共沉淀

去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用冷PBS 洗1 次。加RIPA 裂解液，溶解后，轉(zhuǎn)移到EP 管中用振蕩混勻，離心，上清轉(zhuǎn)移到新的EP 管。往上清分別加入6 ×his 抗體和HA 抗體，4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻過夜，加入Protein A/G PLUS－Agarose，再混勻1 h 后使瓊脂糖(agarose)沉淀，去上清。往瓊脂糖加RIPA，振蕩混勻、離心、去上清。重復(fù)4 次洗凈。加3% SDS 緩沖液20 μL，－20 ℃保存?zhèn)溆谩estern blotting 檢測(cè)Rock2 與Cdc25A 相互作用情況。

10 熒光共定位

細(xì)胞培養(yǎng)后進(jìn)行爬片，4%多聚甲醛固定，0.5%triton 穿孔，10% 正常驢血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，分別以羊抗Rock2 抗體、兔抗Cdc25A 抗體和羊抗Rock2 抗體+兔抗Cdc25A 抗體孵育過夜，PBS 沖洗，以上各組分別用FITC 標(biāo)記的驢抗羊IgG 、TRITC標(biāo)記的驢抗兔IgG 孵育1 h，PBS 沖洗，DAPI (0.1 mg/L)避光孵育30 min，PBS 沖洗后共聚焦顯微鏡觀察并照相。

11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Rock2 與Cdc25A 蛋白在肝癌組織中高表達(dá)且兩者呈正相關(guān)

通過檢測(cè)51 對(duì)肝癌及癌旁組織中Rock2 與Cdc25A 的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Rock2 與Cdc25A 在肝癌組織較癌旁組織呈現(xiàn)高表達(dá)，而且兩者呈正相關(guān)。其中，37 例肝癌組織中兩者呈現(xiàn)過表達(dá)(72.5%)，4例肝癌組織中兩者未見表達(dá)(7.8%)，單純Rock2 或Cdc25A 蛋白表達(dá)過高的有10 例(19.6%)，見圖1。

2 最佳shRock2 干擾質(zhì)粒的篩選

將已構(gòu)建的4 個(gè)shRock2 干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞Huh－7 中，Western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rock2 表達(dá)較對(duì)照組均降低，但shRock2－1 質(zhì)粒效果更明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將用該干擾質(zhì)粒進(jìn)行，見圖2。

3 Rock2 穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞中Cdc25A 蛋白表達(dá)降低

Western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rock2 表達(dá)降低后Cdc25A 蛋白的表達(dá)也隨之減少(P ＜0.05)，表明降低Rock2 的表達(dá)后對(duì)Cdc25A 可能起調(diào)節(jié)作用，見圖3。

4 轉(zhuǎn)染Rock2 突變質(zhì)粒的特異性驗(yàn)證

將已構(gòu)建的針對(duì)Rock2 干擾序列的Rock2 突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Rock2 穩(wěn)定低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株中，Western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rock2 與Cdc25A 的蛋白表達(dá)均“恢復(fù)”，而且肝癌細(xì)胞的增殖也明顯增加，見圖4。

Figure 1. The expression of Rock2 and Cdc25A in human hepatocellular carcinoma tissues (tumor，T)and adjacent liver tissues (nontumor，NT). A:representative Western blotting graphs;B，C:statistical analysis of Rock2 and Cdc25A expression，respectively;D:the relationship between Rock2 and Cdc25A expression. ±s.n=51. * P ＜0.05 vs T.圖1 Rock2 與Cdc25A 在肝癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

5 降低Rock2 表達(dá)后Chk1 和Chk2 蛋白表達(dá)無明顯變化

Chk1 和Chk2 是Cdc25A 上游最主要的調(diào)節(jié)因子［7］。在Rock2 穩(wěn)定低表達(dá)的肝癌細(xì)胞中，Western blotting 檢測(cè)表明Chk1 和Chk2 蛋白的表達(dá)無明顯變化，這表明Rock2 對(duì)Cdc25A 的調(diào)節(jié)并不依賴于Chk1/Chk2，見圖5。

6 Rock2 與Cdc25A 直接相互作用

Rock2 和Cdc25A 發(fā)生了免疫共沉淀作用，表明Rock2 直接作用于Cdc25A，見圖6。

7 Rock2 與Cdc25A 存在共定位

兩個(gè)蛋白之間的共定位通常發(fā)生在當(dāng)熒光標(biāo)記分子位置非常接近或者存在空間一致性時(shí)。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明，Rock2 與Cdc25A 之間存在共定位，見圖7。

討 論

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)乃至世界上常見、且極具危害性的惡性腫瘤之一［8］。盡管近年來對(duì)其診斷、治療技術(shù)不斷進(jìn)步，但肝癌的預(yù)后仍然較差。肝癌確切的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，肝癌的發(fā)生發(fā)展是癌基因的激活和抑癌基因的失活共同作用的結(jié)果［9］。因此，了解肝細(xì)胞癌變過程、原癌基因和腫瘤抑制基因具有重要意義。Rock2 是Rho/Rock 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，近年研究發(fā)現(xiàn)，Rock2 在肝癌，膀胱癌，乳腺癌，睪丸癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過高表達(dá)，而且在惡性腫瘤中其下游作用通路仍不十分清楚。遺傳信息的準(zhǔn)確傳導(dǎo)對(duì)于細(xì)胞生存和癌癥預(yù)防是至關(guān)重要的。

Figure 2. The expression of Rock2 protein was decreased after transfection of shRock2 plasmids and the best shRock2 plasmid was selected. ±s.n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock.圖2 轉(zhuǎn)染shRock2 干擾質(zhì)粒后其蛋白變化明顯降低并篩選出shRock2 最佳干擾片段shRock2－1

Figure 3. The expression of Cdc25A protein was decreased in stable Rock2－knockdown Huh－7 and HepG2 cells. ±s.n=6. ＊＊P ＜0.01 vs mock.圖3 在Rock2 穩(wěn)定低表達(dá)的肝癌細(xì)胞Huh－7 和HepG2 中Cdc25A 蛋白表達(dá)明顯降低

Figure 4. The specificity verification after transfection of Rock2－mutant plasmid.A:the wild－type and mutant Rock2 plasmids(bold letters indicate the silent mutations in the Rock2－mutant plasmid);B:the expression of Rock2 and Cdc25A after transfection with the Rock2－mutant plasmid(Rock2m)into shRock2－treated cells;C:the cell growth after transfection with Rock2m into shRock2－treated cells. ±s.n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs shRock2.圖4 轉(zhuǎn)染Rock2 突變質(zhì)粒的特異性驗(yàn)證

Figure 5. The expression of Chk1 and Chk2 proteins was not changed in stable Rock2－knockdown Huh－7 and HepG2 cells.圖5 在Rock2 穩(wěn)定低表達(dá)的肝癌細(xì)胞Huh－7 和HepG2 中Chk1 和Chk2 的蛋白表達(dá)無明顯變化

Figure 6. Rock2 directly bound to Cdc25A. A:co－immunoprecipitation between 6 ×His－Rock2 and HA－Cdc25A in Huh－7 cells. HA－Cdc25A was detected in the immunoprecipitate when the anti－6 ×his antibody was used as the bait;6 ×his－Rock2 was detected in the immunoprecipitate when the anti－HA antibody was used as the bait. B:the endogenous Rock2 and Cdc25A directly bound to each other.圖6 Rock2 與Cdc25A 之間存在直接結(jié)合

G1/S 期檢查點(diǎn)能夠通過抑制DNA 復(fù)制的開始而阻止細(xì)胞進(jìn)入S 期。細(xì)胞能否開始進(jìn)行增殖，主要調(diào)控點(diǎn)在G1期，它決定了細(xì)胞能否通過G1期而進(jìn)入S 期。Cdc25A 是控制G1/S 期調(diào)節(jié)途徑的重要檢查點(diǎn)蛋白，在轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)激活作用中是一個(gè)重要的效應(yīng)分子［4］。在人細(xì)胞中，Cdc25A 過表達(dá)會(huì)引起Cdk2/cyclin E 依賴激酶的早期激活，導(dǎo)致細(xì)胞過早進(jìn)入S 期，細(xì)胞生長(zhǎng)的失控，及可能引起惡性轉(zhuǎn)化［5］。相反，Cdc25A 表達(dá)的降低可以抑制Cdk2/cyclin E 的活性并阻止Cdc45 直接作用DNA 復(fù)制的起始［10－11］。Cdc25A 與一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)系統(tǒng)相互作用，通過泛素蛋白酶體途徑的降解對(duì)于分裂細(xì)胞和應(yīng)對(duì)DNA 損傷方面都是一個(gè)主要的控制途徑［12］。DNA 損傷時(shí)Cdc25A 的降解對(duì)于細(xì)胞周期阻滯是非常關(guān)鍵的。當(dāng)細(xì)胞中不能降低Cdc25A 表達(dá)時(shí)會(huì)表現(xiàn)出檢查點(diǎn)阻滯功能的障礙，包括抗輻射的DNA 合成及Cdk2活性的升高。研究發(fā)現(xiàn)，Cdc25A在肝癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，而且Cdc25A 過高表達(dá)與侵襲及預(yù)后不良是密切相關(guān)的［5］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，降低肝癌細(xì)胞中Rock2基因的表達(dá)，可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖并使細(xì)胞周期阻滯于G1/S 期。Rock2 作為一個(gè)中介因子，了解其是否對(duì)Cdc25A 具有調(diào)節(jié)作用，對(duì)于全面分析Rock2 在S 期檢查點(diǎn)機(jī)制中的調(diào)節(jié)通路十分重要。

Figure 7. The co－localization of Rock2 and Cdc25A observed by confocal microscopy.圖7 共聚焦顯微鏡顯示Rock2 與Cdc25A 之間存在共定位

鑒于Rock2 與Cdc25A 蛋白在肝癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，本研究通過收集51 例肝癌及癌旁組織標(biāo)本，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Rock2 與Cdc25A 在肝癌組織中高表達(dá)而且兩者呈正相關(guān)。這表明Rock2 與Cdc25A 在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能存在密切聯(lián)系。鑒于Cdc25A是細(xì)胞周期G1/S 期的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)，我們推測(cè)Rock2可能對(duì)Cdc25A 起調(diào)控作用。我們通過構(gòu)建Rock2穩(wěn)定低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株Huh－7 和HepG2，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Cdc25A 蛋白的表達(dá)也隨之下降。進(jìn)而，通過定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了Rock2 突變質(zhì)?！盎謴?fù)”其表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cdc25A 蛋白明顯增加，肝癌細(xì)胞的增殖顯著增強(qiáng)。這表明利用RNA 干擾技術(shù)，Rock2 對(duì)Cdc25A調(diào)控作用存在特異性，消除了RNA 干擾的“脫靶效應(yīng)”，證實(shí)Rock2 是通過調(diào)節(jié)Cdc25A 而發(fā)揮其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。這可能為肝癌的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。Chk1 和Chk2 在調(diào)控細(xì)胞周期與腫瘤的發(fā)生中起重要作用［13］，而且兩者是Cdc25A 上游最重要的直接調(diào)控檢查點(diǎn)蛋白［7］。鑒于它們的重要性，起初我們認(rèn)為Rock2 通過影響Chk1 和Chk2蛋白的變化而對(duì)Cdc25A 起調(diào)節(jié)作用，但在Rock2 穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞中并沒有發(fā)現(xiàn)Chk1 和Chk2 蛋白表達(dá)的變化。這些結(jié)果表明，Rock2 調(diào)節(jié)Cdc25A 不依賴于Chk1/Chk2，這可能是一條新的調(diào)節(jié)通路。既然Rock2 調(diào)節(jié)Cdc25A 不依賴于Chk1/Chk2，我們?cè)O(shè)想Rock2 與Cdc25A 之間是否存在直接的相互作用。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，Rock2 與Cdc25A 蛋白之間具有相互作用。這表明，Rock2 通過直接調(diào)節(jié)Cdc25A而發(fā)揮作用。通過共聚焦顯微鏡，更加直觀的免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明，Rock2 與Cdc25A 蛋白在位置上存在重疊及共定位。

Rock2 通過不依賴于Chk1/Chk2 的方式直接調(diào)節(jié)Cdc25A，這為Rock2 在肝癌中的調(diào)節(jié)機(jī)制研究提供重要線索，將為我們更加深入了解Rock2 在人肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后方面提供了廣闊的思路。

［1］ Matsui T，Amano M，Yamamoto T，et al. Rho－associated kinase，a novel serine/threonine kinase，as a putative target for small GTP binding protein Rho［J］. EMBO J，1996，15(9):2208－2216.

［2］ Riento K，Ridley AJ. Rocks:multifunctional kinases in cell behaviour［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2003，4(6):446－456.

［3］ Shi J，Wei L. Rho kinase in the regulation of cell death and survival［J］. Arch Immunol Ther Exp (Warsz)，2007，55(2):61－75.

［4］ Wong CC，Wong CM，Tung EK，et al. Rho－kinase 2 is frequently overexpressed in hepatocellular carcinoma and involved in tumor invasion ［J］. Hepatology，2009，49(5):1583－1594.

［5］ Mailand N，F(xiàn)alck J，Lukas C，et al. Rapid destruction of human Cdc25A in response to DNA damage［J］. Science，2000，288(5470):1425－1429.

［6］ Xu X，Yamamoto H，Sakon M，et al. Overexpression of CDC25A phosphatase is associated with hypergrowth activity and poor prognosis of human hepatocellular carcinomas［J］. Clin Cancer Res，2003，9(5):1764－1772.

［7］ Palou G，Palou R，Guerra－Moreno A，et al. Cyclin regulation by the S phase checkpoint［J］. J Biol Chem，2010，285(34):26431－26440.

［8］ Llovet JM，Bruix J. Novel advancements in the management of hepatocellular carcinoma in 2008［J］. J Hepatol，2008，48(Suppl 1):S20－S37.

［9］ 張繼紅，梁力建，黃潔夫.Quercetin 調(diào)節(jié)肝癌HepG2 細(xì)胞Fas 表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2008，24(5):997－1001.

［10］ Neganova I，Vilella F，Atkinson SP，et al. An Important role for CDK2 in G1to S checkpoint activation and DNA damage response in human embryonic stem cells［J］.Stem Cells，2011，29(4):651－659.

［11］ Broderick R，Nasheuer HP. Regulation of Cdc45 in the cell cycle and after DNA damage［J］. Biochem Soc Trans，2009，37(4):926－930.

［12］ Pereg Y，Liu BY，O'Rourke KM，et al. Ubiquitin hydrolase Dub3 promotes oncogenic transformation by stabilizing Cdc25A［J］. Nat Cell Biol，2010，12(4):400－406.

［13］ 張 敏，王海艷，游 泳，等. CHK1 shRNA 抑制HeLa細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2008，24(10):1891－1894.