夏 武， 楊宇平， 陳永鳳， 程 娜， 劉巨源△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院1藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，2 第三附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng)453003)

肺間質(zhì)纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是嚴(yán)重威 脅人類健康的疾病，迄今沒有滿意的治療方法［1］。PF 過程中成纖維細(xì)胞(fibroblast，F(xiàn)B)大量增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MB)，MB 能分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，ECM 占據(jù)肺泡腔并導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)不可逆重構(gòu)，造成呼吸衰竭［2］。Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ)是ECM 成分之一，在PF 時表達(dá)顯著增高。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)可被多種細(xì)胞因子和生長因子激活，活化的STAT3 進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理和病理過程?；罨疭TAT 蛋白抑制劑(protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3)能特異性抑制STAT3 蛋白活性，阻斷STAT3 與靶基因結(jié)合。STAT3 在纖維化疾病中的作用還不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)STAT3 對肝臟、皮膚和腎臟的纖維化形成有調(diào)節(jié)作用。全反式維甲酸(all－trans－retinoic acid，ATRA)作用廣泛多樣，已有研究證實ATRA 具有抗纖維化作用，ATRA 能否通過影響STAT3 和PIAS3 的表達(dá)來改善PF 未見報道。因此本研究采用轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF－β1)誘導(dǎo)FB 向MB 轉(zhuǎn)化制作肺纖維化體外細(xì)胞模型并給予ATRA 干預(yù)，應(yīng)用RT－PCR 和Western blotting 方法觀察ATRA 對TGF－β1誘導(dǎo)的HFL－I 細(xì)胞中collagen Ⅲ、STAT3和PIAS3 表達(dá)的影響，探討ATRA 改善肺纖維化的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 試劑與儀器

人胚肺成纖維HFL－I 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;ATRA 購于Sigma，DMSO 溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用;TGF－β1購于Peprotech，10 mmol·L－1HCl 溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用;RT－PCR試劑盒購于寶生物(大連)有限公司;單克隆小鼠抗β－actin、STAT3 抗體和多克隆兔抗p－STAT3 抗體購于Santa Cruz;羊抗小鼠、羊抗兔－HRP 購自武漢博士德公司;PCR 擴(kuò)增儀為ABI 產(chǎn)品;電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)為上海領(lǐng)成生物科技有限公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀為Thermo 產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 HFL－I 細(xì)胞株采用含15%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素(100 kU·L－1)、鏈霉素(100 mg·L－1)的α－MEM 培養(yǎng)液，并于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。所有實驗均采用5 ～7 代細(xì)胞。5 μg·L－1TGF－β1刺激0 h、6 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 后，RT－PCR法檢測collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表達(dá)，刺激0 d、1 d、3 d 和5 d 后，Western blotting 法檢測STAT3 和pSTAT3 表達(dá)。維甲酸干預(yù)實驗分為6 組:正常對照組;5 μg·L－1TGF－β1組;10 μmol·L－1ATRA 組;5 μg·L－1TGF－β1+ 0.1 μmol·L－1ATRA 組;5 μg·L－1TGF－β1+ 1 μmol·L－1ATRA組;5 μg·L－1TGF－β1+ 10 μmol·L－1ATRA 組。TGF－β1與ATRA 同時加入。24 h 后，RT－PCR 法檢測各組細(xì)胞中collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA表達(dá);3 d 后，Western blotting 法檢測STAT3 和pSTAT3 蛋白表達(dá)。

2.2 RT－PCR 檢測collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表達(dá) Trizol 法提取細(xì)胞總RNA 并定量。取總RNA 2 μg 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，各取2 μL 產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增GAPDH、collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃5 min 預(yù)變性;95 ℃30 s，退火30 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán);72 ℃10 min。反應(yīng)后各取2 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以目的片段與內(nèi)參照GAPDH 比值進(jìn)行半定量分析，每組實驗重復(fù)3 次。引物序列、退火溫度和產(chǎn)物大小見表1。

表1 PCR 引物序列、退火溫度和產(chǎn)物大小Table 1. Primers and PCR reaction conditions

2.3 Western blotting 檢測STAT3 和p－STAT3 蛋白表達(dá) 細(xì)胞總蛋白提取方法如下:加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃12 000 r·min－1離心5 min，取上清。Bradford 法測定蛋白濃度。計算含20 μg總蛋白的溶液體積作為上樣量，進(jìn)行SDS－PAGE 電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。STAT3 和p－STAT3Ⅰ抗室溫孵育2 h 后4 ℃過夜，HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h 后，加顯色液發(fā)光，顯影定影。將膠片掃描后用Quantity One 圖像分析軟件進(jìn)行各條帶的灰度值測定。以目的條帶與內(nèi)參照β－actin 的比值作為半定量依據(jù)，每組實驗重復(fù)3 次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 TGF－β1 和ATRA 對HFL－I 細(xì)胞collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表達(dá)的影響

從圖1 中可看出，與正常對照組相比，HFL－Ⅰ細(xì)胞經(jīng)5 μg·L－1TGF－β1誘導(dǎo)后，collagen ⅢmRNA 12 h、24 h 和48 h 均明顯上調(diào)(P ＜0.05)，24 h達(dá)到峰值;STAT3 mRNA 各時點(diǎn)均明顯上調(diào)(P ＜0.05)，24 h 達(dá)到峰值;PIAS3 mRNA 12 h、24 h、48 h 和72 h 均明顯下調(diào)(P ＜0.05)，48 h 達(dá)到峰谷，72 h 部分回升。從圖2 中可知，與正常對照組相比，TGF－β1誘導(dǎo)HFL－I 細(xì)胞經(jīng)24 h 后，collagen Ⅲ、PIAS3 和STAT3mRNA 表達(dá)均與圖1 一致;經(jīng)10 μmol·L－1ATRA 作用24 h 后，collagen Ⅲ、PIAS3 和STAT3 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與TGF－β1誘導(dǎo)組相比，不同濃度ATRA(0.1、1 和10 μmol·L－1)均可下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞中collagen Ⅲ和STAT3 mRNA 的表達(dá)(P ＜0.05)，上調(diào)PIAS3 mRNA 的表達(dá)(P ＜0.05)。

2 TGF－β1 和ATRA 對HFL－Ⅰ細(xì)胞STAT3 和p－STAT3 蛋白表達(dá)的影響

如圖3 所示，與正常對照組相比，HFL－Ⅰ細(xì)胞經(jīng)5 μg·L－1TGF－β1誘導(dǎo)1 d、3 d 和5 d 后，STAT3和p－STAT3 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P ＜0.05)。由圖4可知，與正常對照組相比，TGF－β1誘導(dǎo)HFL－Ⅰ細(xì)胞3 d 后，STAT3 和p－STAT3 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05)，經(jīng)10 μmol·L－1ATRA 作用3 d 后，STAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，p－STAT3 蛋白表達(dá)稍有 上調(diào)(P ＜0.05)。與TGF－β1組相比，不同濃度ATRA(0.1、1 和10 μmol·L－1)均可下調(diào)TGF－β1誘導(dǎo)的STAT3 和p－STAT3 蛋白的表達(dá)(P ＜0.05)。

Figure 1. The expression of collagen Ⅲ，STAT3 and PIAS3 mRNA in TGF－β1－stimulated HFL－I cells detected by RT－PCR. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs 0 h.圖1 RT－PCR 檢測TGF－β1 誘導(dǎo)的HFL－I 細(xì)胞collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 的表達(dá)

Figure 2. Relative expression of collagen Ⅲ，STAT3 and PIAS3 mRNA in the TGF－β1－stimulated HFL－I cells treated with ATRA. Lane 1:10 μmol·L －1 ATRA;Lane 2:TGF－β1 + 0.1 μmol·L －1 ATRA;Lane 3:TGF－β1 + 1 μmol·L －1 ATRA;Lane 4:TGF－β1 + 10 μmol·L －1 ATRA;Lane 5:TGF－β1;Lane 6:control. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF－β1 group.圖2 RT－PCR 檢測ATRA 對TGF－β1 誘導(dǎo)的HFL－I collagen Ⅲ、STAT3 和PIAS3 mRNA 表達(dá)的影響

討 論

大多數(shù)PF 都有共同的病理過程，初期表現(xiàn)為肺泡炎，炎癥和異常修復(fù)導(dǎo)致肺間質(zhì)細(xì)胞增殖，產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺組織的正常結(jié)構(gòu)被囊性空腔所替代，使得肺泡氣體－ 交換單元持久性喪失。PF 時肺結(jié)締組織中存在大量纖維化灶，其中含大量MB，MB 是產(chǎn)生ECM 的主要細(xì)胞，也與ECM 沉積相關(guān)。PF 時還有大量細(xì)胞因子和生長因子活化，包括TGF－β1、表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、結(jié)締組織生長因子(conneetive tissue growth factor，CTGF)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)和白細(xì)胞介素－6(interleukin－6，IL－6)等，這些細(xì)胞因子和生長因子都具有促纖維化作用［3－4］。TGF－β1是至關(guān)重要的纖維化因子，TGF－β1可以誘導(dǎo)肺間質(zhì)FB 發(fā)生表型轉(zhuǎn)化變成MB。Vancheri 等［5］在體外實驗證實了TGF－β1可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化。

本實驗組前期工作顯示5 μg·L－1TGF－β1可以使HFL－I 細(xì)胞α－平滑肌肌動蛋白表達(dá)明顯增加［6］，α－平滑肌肌動蛋白是MB 的標(biāo)志性蛋白［7］，表明FB 部分向MB 轉(zhuǎn)化，而且慢性纖維化疾病患者血清中的TGF－β1濃度接近5 μg·L－1［8］，所以本實驗用5 μg·L－1TGF－β1誘導(dǎo)HFL－I 細(xì)胞向MB轉(zhuǎn)化，制造體外PF 模型。

Figure 3. Relative expression of STAT3 and p－STAT3 proteins in TGF－β1－stimulated HFL－I cells detected by Western blotting.±s.n=3. * P ＜0.05 vs 0 d.圖3 Western boltting 檢測TGF－β1 誘導(dǎo)的HFL－I 細(xì)胞STAT3 和p－STAT3 蛋白的表達(dá)

Figure 4. Relative expression of STAT3 and p－STAT3 proteins in the TGF－β1－stimulated HFL－I cells treated with ATRA.Lane 1:control;Lane 2:TGF－β1;Lane 3:10 μmol·L －1 ATRA;Lane 4:TGF－β1 + 0.1 μmol·L －1 ATRA;Lane 5:TGF－β1 + 1 μmol·L －1 ATRA;Lane 6:TGF－β1 + 10 μmol·L －1 ATRA. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 ATRA vs TGF－β1 group.圖4 Western boltting 檢測ATRA 對TGF－β1 誘導(dǎo)的HFL－I STAT3 和p－STAT3 蛋白表達(dá)的影響

在PF 時，MB 持續(xù)增殖，單個細(xì)胞的生存時間大大延長，包括collagen Ⅲ在內(nèi)的ECM 成分含量顯著增加［9］。有研究提示，collagen Ⅲ可作為判定間質(zhì)纖維化早期或活動期的較好指標(biāo)［10］。本實驗研究表明TGF－β1誘導(dǎo)HFL－Ⅰ細(xì)胞12 h、24 h 和48 h 后collagen ⅢmRNA 表達(dá)較正常對照組相比均明顯上調(diào)(P ＜0.05)。膠原表達(dá)增加可代替肺泡結(jié)構(gòu)，使肺泡壁變形和破壞，加速PF 形成。

STAT3 可以被不同的細(xì)胞因子受體激活，細(xì)胞因子與受體結(jié)合后磷酸化STAT3 蛋白，磷酸化STAT3 蛋白形成同源或異源二聚體進(jìn)入核內(nèi)激活特異性基因表達(dá)。PIAS3 是STAT3 的特異性抑制子，PIAS3 可以通過與二聚化的STAT3 結(jié)合、掩蓋STAT3 的DNA 結(jié)合區(qū)或與STAT3 單體結(jié)合阻礙其二聚化而阻斷STAT3 的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用［11］。Pang等［12］研究發(fā)現(xiàn)STAT3 的抑制劑S3I－201 可以抑制腎纖維化時α－平滑肌肌動蛋白和纖連蛋白的表達(dá)。本研究表明TGF－β1誘導(dǎo)人胚肺成纖維細(xì)胞HFL－I 后，STAT3 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯升高，磷酸化STAT3 蛋白也顯著增加，而PIAS3 mRNA 表達(dá)則明顯下調(diào)，結(jié)果都使核內(nèi)活性STAT3 增加。STAT3 靶基因的表達(dá)產(chǎn)物如Bcl－2、生存素、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等有促進(jìn)細(xì)胞生存、拮抗細(xì)胞凋亡的作用，在PF 的病程發(fā)展中有重要作用［13］?；钚許TAT3 增加，使得Bcl－2、生存素、VEGF 等表達(dá)增加，加速PF病程。

ATRA 是維生素A 在生物體內(nèi)的重要活性形式，其作用復(fù)雜多樣，能促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖，影響骨的生長和上皮代謝，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化等。機(jī)體內(nèi)一定濃度的ATRA 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、成熟，是機(jī)體正常生長發(fā)育和各種生理活動必不可少的重要因子。在體內(nèi)體外的實驗中都發(fā)現(xiàn)ATRA 有抗肺纖維化活性。ATRA 可以抑制肺纖維化大鼠前膠原α1mRNA 表達(dá)和膠原蛋白合成［14］。Tabata 等［15］研究表明，ATRA 可以減輕輻射和博來霉素所致小鼠肺組織纖維化，降低TGF－β1、IL－6 和膠原蛋白的表達(dá)而起抗纖維化作用。本實驗結(jié)果顯示，ATRA 呈濃度依賴地降低TGF－β1誘導(dǎo)的HFL－I 細(xì)胞中collagen ⅢmRNA 表達(dá)(P ＜0.05)，使膠原的合成減少而起抗纖維化作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，各濃度的ATRA都降低TGF－β1誘導(dǎo)的HFL－I 細(xì)胞中STAT3 mRNA 和蛋白表達(dá)及磷酸化STAT3 水平，上調(diào)PIAS3 mRNA 表達(dá)。這表明ATRA 抗纖維化作用與STAT3和PIAS3 有關(guān)，ATRA 可通過抑制STAT3 和p－STAT3 使肺纖維化相關(guān)基因活化減少來改善PF，具體調(diào)控過程與調(diào)控基因有待進(jìn)一步研究。

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