王 通， 馬文心， 郭嘉慧， 陳智鵬， 崔毅峙

(暨南大學(xué)生命與健康工程研究院，廣東 廣州510632)

我國(guó)HIV－1 的流行株主要為B、B'、C 及AE 亞型，其中中國(guó)株HIV－1 病毒主要指我國(guó)B 亞型流行株，針對(duì)其開(kāi)展病毒學(xué)和病理生理學(xué)研究有現(xiàn)實(shí)意義［1］。

目前研究發(fā)現(xiàn)，HIV－1 感染者的癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著提高，從而形成了HIV－1 研究領(lǐng)域的一個(gè)備受關(guān)注的領(lǐng)域，即HIV－1 相關(guān)惡性腫瘤(HIV－1－associated malignancies，HAM)問(wèn)題。HAM 研究主要以隊(duì)列研究為主，目的是確證各種癌癥與HIV－1 感染的相關(guān)性，而罕見(jiàn)針對(duì)HAM 發(fā)生機(jī)制的研究。

已知HIV－1 可在骨髓中感染造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，以整合(原病毒)和未整合(胞漿HIV－1 DNA)形式建立潛伏感染，持續(xù)慢性復(fù)制和釋放子代病毒［2－3］。原病毒在高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active anti－retroviral therapy，HAART)下不會(huì)被根除，仍可在外周血單核細(xì)胞中持續(xù)，成為組織HIV－1 的來(lái)源［4］。例如，在HIV 腦傳播機(jī)制中，有“木馬假說(shuō)”認(rèn)為，攜HIV DNA 的單核細(xì)胞可能跨血腦屏障，在大腦中建立HIV 感染［5］。而未整合HIV－1 DNA 也可能通過(guò)類似的木馬機(jī)制被單核細(xì)胞傳播至組織。這些攜有HIV DNA 的單核細(xì)胞將會(huì)分化為含HIV DNA 的巨噬細(xì)胞，并進(jìn)而啟動(dòng)組織炎癥產(chǎn)生應(yīng)答，從而提供多種刺激細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子，包括IL－6、TNF－α 和IL－1［6］。

這些促增殖細(xì)胞因子可能是誘發(fā)HAM 的一個(gè)主要因素，HIV－1 gp120 蛋白就是這些因子在巨噬細(xì)胞內(nèi)上調(diào)的病毒來(lái)源激動(dòng)蛋白之一。因此，本研究首先構(gòu)建可表達(dá)HIV－1 Gp120 蛋白的重組腺病毒，并將HIV－1 gp120 DNA 導(dǎo)入小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(bone marrow－derived macrophages，BMM)，并研究這種含HIV－1 gp120 DNA 的BMM(BMM－gp120)的形態(tài)學(xué)表型變化特征。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要材料 人胚腎轉(zhuǎn)化細(xì)胞293Ad5+細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC);6 ～8 周齡BALB/c 小鼠購(gòu)自暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;流式細(xì)胞儀FACS Aria 購(gòu)自BD。腺病毒純化試劑盒購(gòu)自Biomiga;Millipore 0.22 μm 濾膜購(gòu)自Syringe;14 kD 透析膜購(gòu)自聯(lián)合碳化物公司。

1.2 主要試劑 pDC316－mCMV－EGFP 和pBHGlox－E1，3Cre 質(zhì)粒由深圳市百恩維生物科技有限公司提供;中國(guó)株HIV－1CNgp120 基因由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)王福祥教授惠贈(zèng)［7］。LipofectamineTMLTX、PLUSTMReagents、PE 結(jié)合的抗鼠CD11b 單克隆抗體、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、雙抗和ACK Lysing Buffer 均購(gòu)自Invitrogen。HIV－1 gp120 ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海豐翔生物科技有限公司。M－CSF(macrophage colony－stimulating factor)購(gòu)自R＆D。極低貼壁6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自Corning。核酸內(nèi)切酶Nhe I 與Hind III 購(gòu)自TaKaRa。

2 方法

2.1 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 本部分由深圳百恩維公司協(xié)助完成，以質(zhì)粒pEGFP－N1－gp120為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增gp120 基因，并克隆至pDC316－mCMV－EGFP 質(zhì)粒，獲得pDC316－mCMV－EGFP－gp120 穿梭質(zhì)粒。用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，并分別用Nhe I 與Hind III 進(jìn)行酶切鑒定。

2.2 重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增 將293Ad5+細(xì)胞以5 ×105cells /well 接種于6 孔板中。用含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基(無(wú)抗生素)，并置37 ℃、5%CO2的溫度濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加pBHGlox－E1，3Cre 質(zhì)粒4 μL、pDC316－mCMV－EGFP或pDC316－mCMV－EGFP－gp120 穿梭質(zhì)粒1 μL，以及Lipofectamine 10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)綠熒光細(xì)胞比例，確定轉(zhuǎn)染效率。繼而每24 h 觀察1 次并記錄細(xì)胞形態(tài)變化。待板孔內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)滿后，將所有細(xì)胞及培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入T25 培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，再度長(zhǎng)滿后續(xù)轉(zhuǎn)T75 瓶。總計(jì)約10 d后，可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)葡萄狀聚團(tuán)即細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，此時(shí)輕柔吹落細(xì)胞并收集，再用1 mL PBS 重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞反復(fù)置于－80 ℃及37 ℃凍融3 次。離心收取凍融液，為第1 代病毒。將293Ad5+細(xì)胞接種于T75 瓶中，待其長(zhǎng)至80% 匯合度(confluence)，加入500 μL 第1 代病毒，并用含抗生素、5% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，直至細(xì)胞出現(xiàn)CPE 現(xiàn)象時(shí)，收集培養(yǎng)基及細(xì)胞凍溶液以獲得第2 代病毒。

2.3 重組腺病毒的純化 該方法的原理是以病毒特異性親和柱捕獲重組腺病毒，進(jìn)而洗脫病毒達(dá)到純化目的。具體操作為取15 mL 離心管，棄蓋，將病毒純化柱裝入，300 ×g 離心2 min。掰斷純化柱下蓋，讓原浸柱液流出。后加入2 mL 超純水，及5 mL 1 × wash buffer。將含第2 代病毒的培養(yǎng)基和細(xì)胞凍融液以0.22 μm 濾膜過(guò)濾除雜后上樣。待樣品液過(guò)柱后，加入2 ～3 mL 1 × elution buffer，將被柱吸附的病毒洗脫。收集洗脫液裝入14 kD 孔徑透析袋，以D－PBS 為透析液，4 ℃過(guò)夜透析病毒樣品。透析最長(zhǎng)時(shí)間≤18 h。待樣品脫色至透明后，收集樣品。再次以0.22 μm 濾膜過(guò)濾除雜。得到工作病毒，以－80 ℃凍存。

2.4 重組腺病毒ELISA 鑒定 設(shè)標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度為1 ×10－7mg/L、5 ×10－8mg/L、2.5 ×10－8mg/L 和0 mg/L，以DMEM 培養(yǎng)基及PBS 為對(duì)照。樣品稀釋5倍加入，每個(gè)樣品做3 個(gè)復(fù)孔，分別為Ad－HIV－1 gp120 感染細(xì)胞的培養(yǎng)基上清(Ad－gp120 supernatant)和細(xì)胞裂解液(Ad－gp120 cell lysate);Ad－GFP 感染細(xì)胞的培養(yǎng)基上清(Ad－GFP supernatant)和細(xì)胞裂解液(Ad－GFP cell lysate)。加樣后封板4 ℃過(guò)夜，洗板，每孔加入酶標(biāo)試劑(結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的抗gp120 抗體)50 μL，37 ℃溫育30 min。再次洗板，加顯色液避光15 min。終止顯色后以450 nm 波長(zhǎng)測(cè)吸光度值。

2.5 重組腺病毒TCID50滴度測(cè)定 將生長(zhǎng)狀況良好的293Ad5+細(xì)胞以每孔1 ×104接種于96 孔板中，每孔培養(yǎng)體積為100 μL，培養(yǎng)24 h 后，每孔分別加入100 μL 不同稀釋度的重組病毒液(包括:10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10和10－11)。培養(yǎng)3 d 后，熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)。按照Karber 公式［8］，病毒滴度為T(mén) =10L－d(s－0.5)，L =log10(最高稀釋度)，d = log10(稀釋度差值)= 1，s = 陽(yáng)性比率之和，計(jì)算病毒效價(jià)。

2.6 重組腺病毒滴度感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)復(fù)驗(yàn) 擇6 ～8 周齡小鼠，頸椎脫臼法處死后酒精消毒，生物安全柜內(nèi)解剖，取其完整股骨及脛骨，除凈肌肉，去骨兩端，用DMEM 沖出骨髓，250 ×g離心5 min 收集沉淀，以適當(dāng)比例ACK 裂解紅細(xì)胞雜質(zhì)，過(guò)70 μm 濾膜收集骨髓單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞按1×106cells/well，接種于極低貼壁6 孔板內(nèi)。加入含10 μg/L M－CSF 及10% FBS 的DMEM 分化培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，得到分化成熟的BMM。向每孔BMM 細(xì)胞分別加入不同濃度的P1 代Ad－GFP 及Ad－gp120病毒各100 μL(設(shè)置MOI 梯度為0.1、1 和10)。48 h 后，將各孔細(xì)胞分別收集入EP 管，PBS 洗1 次，以100 μL PBS 重懸細(xì)胞，按每1 ×106cells /well 對(duì)應(yīng)0.3 μL CD11b－PE 之比例加入CD11b－PE 抗體混勻，避光靜置30 min 后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CD11b 陽(yáng)性細(xì)胞為BMM，GFP 陽(yáng)性細(xì)胞為感染細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變用熒光顯微鏡觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果利用FlowJo 7. 6. 5 軟件分析(TreeStar)。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 5.0.2 軟件分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Student's t 檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功獲得重組腺病毒質(zhì)粒

用Nhe I 與Hind III 對(duì)pDC316－mCMV－EGFP－gp120 質(zhì)粒做酶切鑒定后在電泳凝膠的約4.5 kb位置出現(xiàn)DNA 條帶，分子量與gp120 基因相符。經(jīng)測(cè)序表明，穿梭質(zhì)粒所攜帶gp120 確為中國(guó)株HIVCN基因［7］。

2 成功構(gòu)建重組腺病毒

由于AdMax 系統(tǒng)所用骨架質(zhì)粒為缺陷病毒基因組，故此病毒僅能借助特殊細(xì)胞系293Ad5+的細(xì)胞基因組Ad5+區(qū)互補(bǔ)完善自身，并跟隨細(xì)胞復(fù)制而自行復(fù)制。感染后培養(yǎng)48 h，光鏡觀察可見(jiàn)貼壁細(xì)胞出現(xiàn)漂浮、團(tuán)聚，并呈葡萄狀等典型的CPE 現(xiàn)象，見(jiàn)圖1A、B;其熒光視野可見(jiàn)GFP 熒光。根據(jù)AdMax系統(tǒng)工作原理，當(dāng)細(xì)胞可表達(dá)GFP 時(shí)可證明穿梭質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒已經(jīng)通過(guò)Cre/LoxP 重組整合，表明腺病毒胞內(nèi)組裝成功，即攜中國(guó)株HIV－1 gp120 基因的重組腺病毒(Ad－gp120)及其對(duì)照空載病毒(Ad－GFP)構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。為了最大程度上減少變異，本研究所有感染實(shí)驗(yàn)所用重組腺病毒均為1 ～3代病毒。

Figure 1. The cytopathic effects of recombinant adenoviruses on infected 293Ad5 + cells.Scale bar = 20 μm.圖1 重組腺病毒感染293Ad5 +細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)觀察

3 HIV－1 gp120 蛋白表達(dá)

由于AdMax 系統(tǒng)的目的基因和GFP 為分別表達(dá)，因此，我們采用ELISA 技術(shù)對(duì)HIV－1 gp120 蛋白表達(dá)進(jìn)行確證性研究。作為陰性對(duì)照，培養(yǎng)基和PBS 對(duì)照的吸光度值平均值，以及樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的Y軸節(jié)距均在0.31 左右，因此我們將本ELISA 檢測(cè)低限(lower limit of detection，LLD)設(shè)置在0.31，見(jiàn)圖2。該LLD 高于對(duì)照組(Ad－GFP)感染的細(xì)胞裂解液和上清以及Ad－gp120 感染的細(xì)胞培養(yǎng)上清的吸光度值。據(jù)此，僅有Ad－gp120 細(xì)胞裂解所得上清(Ad－gp120 cell lysate)的吸光度值顯著高于其它各組，見(jiàn)圖2，其為gp120 蛋白陽(yáng)性，且蛋白濃度均值為4.1 ×10－8mg/L。這表明Ad－gp120 在293Ad5+細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了gp120 蛋白。

4 重組腺病毒滴度測(cè)試及MOI 復(fù)驗(yàn)

按照Karber 法計(jì)算，Ad－gp120 病毒滴度為108.3TCID50/mL;Ad－GFP 病毒滴度為108.1TCID50/mL。以此滴度為依據(jù)設(shè)定MOI 梯度感染BMM，流式結(jié)果符合TCID50法計(jì)算所得結(jié)果，見(jiàn)圖3。巨噬細(xì)胞本身不含GFP，故可依據(jù)綠熒光的比率判斷病毒的感染效率。在MOI = 0.1 時(shí)，33.2%的細(xì)胞為GFP陽(yáng)性，而當(dāng)MOI = 1 和10 的時(shí)候，該比率上升到84.7%和84.9%。在MOI 相差10 倍時(shí)熒光比率沒(méi)有更大變化，可證明MOI=1 時(shí)已基本達(dá)到最大感染率，見(jiàn)圖3。其中，BMM 的純度由CD11b+細(xì)胞所占比率反映，從圖3 可見(jiàn)，各組CD11+BMM 所占比率均高于93%。

5 Ad－gp120 感染的巨噬細(xì)胞的表型改變

Figure 2. Expression of HIV－1 gp120 in 293Ad5 + cells.LLD:lower limit of detection，which is 0.31. ±s. n =3.＊＊P ＜0.01 vs other groups.圖2 gp120 蛋白在293Ad5 +細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 3. Capacity of Ad－gp120 of infecting BMM at different MOI (from left to right:control，MOI=0.1，MOI=1，MOI=10).圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同MOI 梯度的Ad－gp120 感染BMM 的能力

在MOI 等于1 時(shí)，不同重組腺病毒感染BMM 出現(xiàn)了顯著的形態(tài)差別，見(jiàn)圖4。BMM 在Ad－GFP 感染下，呈貼壁生長(zhǎng)，并主要為梭形和圓形，見(jiàn)圖4A、B。而在Ad－gp120 感染后，表現(xiàn)為包括拉長(zhǎng)、偽足形成、分枝和不規(guī)則形變等，見(jiàn)圖4C、D。尤其是，Ad－gp120 感染的BMM 的細(xì)胞形狀指數(shù)(shape index=細(xì)胞長(zhǎng)度/細(xì)胞平均寬度)顯著高于Ad－GFP 細(xì)胞［P ＜0. 05，n = 10，即從高倍視野(high power fields，HPF)中隨機(jī)選取10 個(gè)細(xì)胞］，見(jiàn)圖4E。這表明，Ad－gp120 感染可介導(dǎo)BMM 形態(tài)改變。

討 論

HIV－1 gp120 由env 基因所編碼，是HIV 的包膜蛋白，為HIV 主要毒性因子之一，可特異性識(shí)別和結(jié)合CD4 和CCR5/CXCR4 等細(xì)胞表面受體，介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合進(jìn)入細(xì)胞;或可橋聯(lián)含HIV 細(xì)胞與正常細(xì)胞的融合以介導(dǎo)病毒感染正常細(xì)胞［9］。gp120 可通過(guò)內(nèi)源和外源途徑促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分泌巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α，MIP－1α)、MIP－1β、受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(regulated upon activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES)、IL－1β、TNF－α、IL－10 等細(xì)胞因子，同時(shí)還包括全部3 種絲裂原激活蛋白激酶，即ERK、p38 和JNK［6］。這些炎癥應(yīng)答產(chǎn)物均與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和分化等有密切關(guān)系。

HIV DNA 在巨噬細(xì)胞內(nèi)不整合即降解［10］。但目前研究發(fā)現(xiàn)，未整合的HIV DNA 在巨噬細(xì)胞中至少可持續(xù)30 d，期間HIV－1 env(包括gp120 和gp41)、nef 和tat 等病毒基因持續(xù)轉(zhuǎn)錄，而rev 和vif幾乎不轉(zhuǎn)錄，體現(xiàn)了潛伏感染的特征［11］。本研究所提供的BMM－gp120 細(xì)胞正是HAM 周?chē)琀IV－1 DNA 巨噬細(xì)胞的理想模型，從而有利于進(jìn)一步開(kāi)展HAM 的機(jī)制研究。

腺病毒的滴定方法通常為紫外分光光度法測(cè)VP 值，但此法不能排除包裝缺陷病毒或無(wú)感染能力病毒顆粒［12－13］。故本實(shí)驗(yàn)采用并改進(jìn)了可檢活病毒感染力的TCID50滴度測(cè)試法［14］。傳統(tǒng)TCID50測(cè)定需通過(guò)觀察細(xì)胞CPE 有無(wú)判斷陽(yáng)性與否，故一般需10 d 左右知道結(jié)果。而本實(shí)驗(yàn)中的病毒可表達(dá)GFP，故我們觀察到有綠熒光孔基本可判斷為陽(yáng)性孔。本研究表明，滴毒后24 h 可見(jiàn)綠熒光，滴毒3 d后則可確定陽(yáng)性孔數(shù)量，且由于此時(shí)陽(yáng)性孔內(nèi)熒光點(diǎn)數(shù)基本 ＞3 處，假陽(yáng)性孔也可以被區(qū)分。

Figure 4. Morphological changes of recombinant adenovirus－infected BMM. ±s.n=10. * P ＜0.05 vs Ad－GFP.圖4 重組腺病毒感染BMM 的形態(tài)學(xué)改變

近年來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)因其檢測(cè)快捷，結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)病毒感染方面得到了廣泛運(yùn)用，但也有諸多論文指出其誤差率較大［15］。故本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用傳統(tǒng)TCID50滴度測(cè)試和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MOI 法，相互印證以保證病毒滴度結(jié)果的可信度。

AdMax 系統(tǒng)構(gòu)建重組腺病毒有較多優(yōu)點(diǎn)，包括同源重組效率較高、從質(zhì)粒構(gòu)建到重組出毒時(shí)間短，且在293Ad5+中，其轉(zhuǎn)染成功率大于98%。另外，有報(bào)道指出該系統(tǒng)出毒后，95%的病毒子含目的基因，故非常有利于目的基因的功能研究［16］。

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