梁 莉 劉洪臣 鄂玲玲 王東勝

牙周炎是一種口腔常見的細菌感染性疾病，牙周致病菌是通過多種炎性因子和細胞毒性作用產(chǎn)生對牙周組織的破壞性影響，導(dǎo)致牙周組織中的RANKL/RANK/OPG調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡，最終造成牙周膜、牙槽骨破壞[1]。IL-6是一種多功能的細胞因子具有許多和牙周炎發(fā)病機制相關(guān)的活性。內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)作為一種縮血管肽具有多種功能，與各種細胞因子之間存在復(fù)雜的聯(lián)系，研究表明[2]，ET-1與牙周炎的發(fā)生有極為密切的關(guān)系而且參與了細胞因子的調(diào)節(jié)，但ET-1在牙周炎發(fā)病機制中的作用機理尚不清楚。因此，我們通過研究ET-1對牙周膜細胞IL-6表達的影響，為探討ET-1在牙周炎發(fā)病機制中的作用機理奠定基礎(chǔ)，進而為尋求治療牙周炎提供可能的途徑。

1.材料和方法

1.1主要試劑 內(nèi)皮素-1(sigma，美國),DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，胎牛血清(FCS)(浙江金華清湖犢牛利用研究所)，胰蛋白酶(Gibco，美國)，DG-3022型酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀(南京華東電子儀器廠)。

1.2人牙周膜細胞的培養(yǎng)[3]選取11-13歲因正畸需要而拔除的前磨牙，無菌條件下刮取牙根中1／3的牙周膜組織，剪成1.0mm×1.0mm×1.0mm小塊，平鋪于25m l培養(yǎng)瓶底，加入含10%FCS的DMEM 培養(yǎng)液，放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2、100%濕度條件下培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。待細胞長至培養(yǎng)瓶底約80%時,即可按1∶2傳代。棄去原培養(yǎng)基,用PBS洗滌一次,加入0.25%胰蛋白酶及0.2%EDTA 2m l消化。相差顯微鏡下觀察,待大多數(shù)牙周膜細胞已收縮變圓且與瓶壁分離(約10m in)，加入含10%胎牛血清DMEM 終止反應(yīng)。反復(fù)吹打后離心(800r/m in,5m in)。調(diào)整細胞密度，按4×105/瓶密度接種。取4-8代細胞進行實驗。

1.3 ET-1對牙周膜細胞IL-6蛋白的影響 牙周膜細胞按1×105/孔的密度接種于六孔板，培養(yǎng)12h待其貼壁，換無血清DMEM培養(yǎng)基沉默過夜。加入不同濃度(1，10，100nM)的ET-1，以未作任何處理的牙周膜細胞為空白對照。為明確內(nèi)皮素作用的特異性，培養(yǎng)基內(nèi)加入ET-1(100nM)，內(nèi)皮素受體ETA拮抗劑BQ123(100nM)和ETB拮抗劑BQ788(100nM)[4]作陰性對照。12h提取細胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書的檢測方法進行操作，檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6蛋白水平。

1.4 ET-1對牙周膜細胞IL-6m RNA表達的影響 收集上述各組細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA。本研究采用SYBRGreenⅠ嵌合熒光法對PCR擴增產(chǎn)物做實時定量評估。PCR擴增條件：95℃預(yù)變性10 m in；95℃15s，60℃1m in，72℃30s，40個循環(huán)；72℃8m in。Applied Biosystem 7500Softw arev 2.0軟件分析IL-6與內(nèi)參GAPDH相對比值，以定量評估IL-6表達水平。合成Real-time PCR引物如下：

IL-6

上游引物：5′-TTGGGACTGATGTTGTTG AC-3′

下游引物：5′-GGCAAATTTCCTGGTTAT ATCC-3′

GAPDH

上游引物：5′-GGAAAGCTGTGGCGTGA T-3′

下游引物：5′-AAGGTGGAAGAATGGGAG TT-3′

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)用spssv 13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(M ean±SEM)表示。應(yīng)用ANOVA檢驗多個樣本均數(shù)間差異。設(shè)P<0.05為差異具有顯著性。

2.結(jié)果

2.1 ET-1對牙周膜細胞IL-6蛋白的影響

ELLSA檢測結(jié)果顯示：ET-1(1，10，100nM)劑量依賴性地促進牙周膜細胞IL-6的分泌。與空白對照組相比，ET-1(1，10，100nM)對牙周膜細胞IL-6分泌具有顯著的促進作用(P<0.05)(表1，圖1)。但加入BQ123(100nM)和BQ788(100nM)后,牙周膜細胞IL-6表達水平與對照組沒有明顯差異(表1，圖2)。內(nèi)皮素受體ETA拮抗劑BQ123和ETB拮抗劑BQ788可抑制ET-1對牙周膜細胞IL-6分泌的促進效應(yīng)。

表1 ET-1對牙周膜細胞IL-6蛋白的影響

圖1 ET-1對牙周膜細胞IL-6蛋白表達的影響(*P<0.05)

圖2 ET受體拮抗劑對牙周膜細胞IL-6蛋白表達的影響(*P<0.05)

2.2 ET-1對牙周膜細胞IL-6m RNA表達的影響 實時定量PCR分析結(jié)果顯示：與空白對照組相比，ET-1(1nM)處理組牙周膜細胞IL-6m RNA表達無明顯改變，ET-1(10或100nM)處理組牙周膜細胞IL-6mRNA表達明顯增強(P<0.05)(表2，圖3)，ET-1(1，10或100nM)劑量依賴性地促進牙周膜細胞IL-6m RNA表達。而陰性對照組牙周膜細胞IL-6m RNA表達水平與對照組沒有明顯無差異(表2，圖4)，內(nèi)皮素受體ETA拮抗劑BQ123和ETB拮抗劑BQ788可抑制ET-1對牙周膜細胞IL-6mRNA表達的促進效應(yīng)。

表2 ET-1對牙周膜細胞IL-6mRNA表達的影響

圖3 ET-1對牙周膜細胞IL-6m RNA表達的影響(*P<0.05)

圖4 ET受體拮抗劑對牙周膜細胞IL-6mRNA表達的影響(*P<0.05)

3.討論

一般認為，牙周炎的組織損傷是牙周病原體及其代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)引起的，免疫細胞及局部組織細胞(如牙周膜細胞)分泌炎性因子參與這一過程。這些因子在牙周炎的發(fā)生和修復(fù)過程中也扮演著重要的角色。IL-6是一種多功能的細胞因子,具有許多和牙周炎發(fā)病機制相關(guān)的活性，在牙周炎癥造成的組織破壞過程中起局部調(diào)節(jié)作用，是炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答中十分重要的調(diào)節(jié)因子[5]。

內(nèi)皮素(endothelin，ET)是日本學(xué)者從豬的主動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的上清液分離純化的一種血管活性肽，是迄今所知活性最強的血管收縮因子[6]，具有多種功能，與各種細胞因子之間存在復(fù)雜的聯(lián)系，在各種炎癥細胞中都有表達。研究發(fā)現(xiàn)，ET-1與牙周炎的發(fā)生有極為密切的關(guān)系[2]。在牙周炎病理過程中，ET-1在炎癥牙周組織和細胞中含量顯著升高，并參與了細胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)。牙周炎致病菌與ET-1參與牙周炎癥有著密不可分的關(guān)系[7]。基因多態(tài)性分析也表明ET-1基因與成人牙周炎易感性可能存在一定的關(guān)系[8]。但內(nèi)皮素-1在牙周炎發(fā)病機制中的作用機理尚不清楚。

在本研究中，我們從蛋白水平和基因水平證實，ET-1可以明顯地促進牙周膜細胞IL-6的表達，而且這種促進作用隨內(nèi)皮素-1濃度的增高而逐漸明顯。但內(nèi)皮素受體拮抗劑抑制了ET-1對牙周膜細胞IL-6分泌的促進效應(yīng)，結(jié)果提示ET-1可能是通過上調(diào)牙周膜細胞IL-6的表達參與牙周炎的發(fā)病過程，通過抑制ET-1的作用可以下調(diào)IL-6引發(fā)的炎性反應(yīng)，使用內(nèi)皮素受體拮抗劑有望成為控制牙周炎的新途徑。

因此，本研究發(fā)現(xiàn)ET-1可以明顯地促進牙周膜細胞IL-6的表達，但內(nèi)皮素受體拮抗劑抑制了ET-1對牙周膜細胞IL-6分泌的促進效應(yīng)，這對進一步研究內(nèi)皮素-1在牙周炎發(fā)病機制中的作用機理奠定了基礎(chǔ)，進而為尋求治療牙周炎提供可能的途徑。

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[3] 梁 莉，劉洪臣，周 威，等.牙周膜成纖維細胞對成骨細胞細胞數(shù)量和堿磷酶活性的影響[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，10(2)：72-74

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