黨 平 聶敏媛 董 亮 崔三哲 湯楚華 史 亮 鄭翰圣 董 蕊 施生根

了解特異組織的特征基因表達(dá)譜被認(rèn)為是未來再生醫(yī)學(xué)成功修復(fù)中老年患者靶器官的關(guān)鍵步驟之一[1]。而近十年來，基因芯片等高通量手段對(duì)上述研究起到了極大的推動(dòng)作用，被廣泛應(yīng)用于各種組織和細(xì)胞的基因特異表達(dá)譜研究[2]。但如果被研究細(xì)胞量少，或位于組織深部而受混雜細(xì)胞所干擾，目標(biāo)細(xì)胞的特征基因表達(dá)往往會(huì)被其他無關(guān)組織基因表達(dá)的“噪聲”所掩蓋。激光顯微切割(Laser m icrodissection，LMD)能讓研究者從三維異質(zhì)性組織中精確分離相對(duì)單一細(xì)胞群并提取其中核酸進(jìn)行分析[3,4]。但制約該技術(shù)應(yīng)用的問題之一即是激光切割過程可能對(duì)樣品總RNA完整度帶來的影響[5]，RNA的降解甚至?xí)绊懙綄?duì)后續(xù)基因表達(dá)結(jié)果的解讀[6,7]。

影響組織RNA降解的RNA酶分為外源性和內(nèi)源性，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段的用品和實(shí)驗(yàn)環(huán)境的準(zhǔn)備是為了盡量消除外源性RNA酶的影響；而內(nèi)源性酶的作用則與親水環(huán)境關(guān)系密切。另外環(huán)境中過大濕度會(huì)影響激光切割效率，因此以乙醇預(yù)處理切割前的組織切片不失為一種簡便易行的方法。既往文獻(xiàn)曾有過用乙醇配置染色溶液和以不同乙醇條件預(yù)處理組織切片的報(bào)道[8,9]。

本研究比較以兩種方式乙醇預(yù)處理未經(jīng)染色的冰凍組織切片，考察其對(duì)后續(xù)提取小鼠牙胚組織樣品總RNA完整度的影響。

1.材料和方法

1.1試劑和儀器 異戊烷(sigma，美國)，100%無水乙醇(Merck KGaA，德國)，OCT冷凍包埋劑(Shandon，英國)，無RNase水(Invitrogen，美國)，RNaseAWAY(Invitrogen，美國)，LMD6000顯微切割系統(tǒng)(Leica，德國)，2100生物分析儀(Agilent，美國)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)用品準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為CD1小鼠，實(shí)驗(yàn)所用時(shí)期分別為胚胎期17天(E17)、和生后2天(PN2)。孕期的確定：前一天下午或晚上合籠，第二天早上檢查發(fā)現(xiàn)陰栓，當(dāng)天即記為E0天。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自韓國Koatech生物公司，實(shí)驗(yàn)在韓國延世大學(xué)牙科學(xué)院解剖發(fā)育學(xué)教研室完成。

因?qū)嶒?yàn)涉及RNA提取步驟，而RNA酶無處不在，所以必須在整個(gè)操作過程中避免產(chǎn)生新的RNase污染。加樣槍頭、EP管等耗材盡量使用一次性新開封的，玻璃器皿應(yīng)在配置好的0.1%DEPC水進(jìn)行8-12h的浸泡，經(jīng)高壓滅菌使DEPC滅活，再進(jìn)行幾個(gè)小時(shí)的烘干，方可使用。

1.3取材 以鋒利剪刀快速切取小鼠下頜組織，在DEPC-PBS中漂洗去血液，投入1.5m l裝有異戊烷的離心管內(nèi)，將裝有組織的離心管放入液氮盒內(nèi)，約6-8s，見到組織發(fā)白即可取出，冷凍時(shí)間不宜過長。倒出組織塊后，迅速將其置入有OCT冷凍包埋劑的包埋模具內(nèi)，迅速調(diào)整組織塊包埋位置，再放回液氮盒中冷凍，注意勿使液氮液面高于組織塊，取材全過程應(yīng)使包埋組織塊受保護(hù)于液氮中。

1.4冰凍切片 先以40um進(jìn)行粗切，待牙胚大致形態(tài)出現(xiàn)后，再換用20-25μm細(xì)切兩層。此時(shí)可以刀片修包埋塊形態(tài)，使OCT邊緣緊貼組織即可。可在光鏡下選樣，待找到需要的形態(tài)結(jié)構(gòu)后，準(zhǔn)備好LMD覆膜切片，開始收集。

1.5兩種乙醇預(yù)處理步驟 待以覆膜切片集齊所需組織切片后，第一種方式采用直接以100%無水乙醇預(yù)處理覆膜組織切片5-10s后晾干；第二種方式為以70%，80%，90%，100%乙醇各5-10s梯度脫水后晾干。須注意的是兩種方式均應(yīng)待OCT包埋劑稍干燥后再以乙醇預(yù)處理，觀察到表面干燥后再存放入冰切機(jī)機(jī)箱。對(duì)照組為未經(jīng)乙醇預(yù)處理的無預(yù)處理LMD組。

1.6 Leica LMD6000激光顯微切割操作流程

(1)按順序打開顯微操作平臺(tái)、激光發(fā)生器、軟件計(jì)算機(jī)的電源。

(2)打開Leica顯微切割操作軟件。

(3)設(shè)置軟件操作參數(shù)：放大倍數(shù)為10x-20x；線條為連續(xù)，封閉；切割精度為精確切割；切割時(shí)間為選擇后切割。

(4)將切片放置于載片架上，將0.2m l PCR管放置于持管架上，管蓋內(nèi)加入30μL細(xì)胞裂解液。

(5)選定目標(biāo)組織或細(xì)胞群，點(diǎn)擊開始切割，附有選定的目標(biāo)細(xì)胞群PEM 膜即會(huì)落入下方管蓋內(nèi)的細(xì)胞裂解緩沖液中。

1.7組織RNA的抽提 以美國Ambion公司RNA queousM icro Kit抽提試劑盒提取組織RNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 RNA樣品質(zhì)量控制 以美國安捷倫公司2100生物分析儀的RNA 6000微流芯片對(duì)組織RNA 樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，用其提供的核糖體RNA 28s/18s比值(28s/18sRatio)、RNA完整度數(shù)值(RNA Integrity Number，RIN)，以及樣品電泳圖的圖形來綜合判斷樣品完整度。

1.9數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 利用SPSS16.0軟件包對(duì)無預(yù)處理切割組、100%乙醇處理組組與梯度乙醇處理組之間樣品RNA完整度RIN值，28s/18s Ratio均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組之間的差異使用方差分析，組間兩兩比較使用Student-Newman-Keuls test檢驗(yàn)。

2.結(jié)果

不同乙醇預(yù)處理方式對(duì)提取樣品RNA完整度的影響。

本實(shí)驗(yàn)意在明確不同乙醇處理方式是否可以提高LMD過程中樣品抗降解能力。結(jié)果顯示100%乙醇直接預(yù)處理組，RIN值最高且與另兩組相比差異有顯著性，梯度乙醇處理組RIN值與無預(yù)處理LMD組相比，并無顯著性差異(見附表、圖1、圖2)。以28s/18sRatio值為指標(biāo)，100%乙醇預(yù)處理組高于其它兩組，但差異并無顯著性；梯度乙醇處理組與無預(yù)處理LMD組間差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

附表 不同乙醇預(yù)處理對(duì)提取樣品RNA完整度(RIN值、28s/18sRatio，±s)的影響

附表 不同乙醇預(yù)處理對(duì)提取樣品RNA完整度(RIN值、28s/18sRatio，±s)的影響

注：100%乙醇處理組RIN 值高于其余兩組，且兩差異均有顯著性，*p＜0.05。

樣品 Ratio(28s/18s) RIN無預(yù)處理LMD 組梯度乙醇處理組100%乙醇處理組7.0±0.78 7.2±0.36 8.3±0.49*1.75±0.48 1.78±0.63 1.91±0.71

圖1 無預(yù)處理LMD組、梯度乙醇處理組、100%乙醇處理組三組樣品RNA電泳圖(峰值模式)

圖1電泳峰值模式圖顯示梯度乙醇處理組與無預(yù)處理組RNA樣品18S峰值高于28S，而100%乙醇預(yù)處理組則相反。圖2電泳遷移模式圖顯示各組樣品18S、28S條帶清晰，而100%乙醇預(yù)處理組28S亮度比18s亮度更高。

圖2 無預(yù)處理LMD組、梯度乙醇處理組、100%乙醇處理組三組樣品RNA電泳圖(遷移模式)

3.討論

再生醫(yī)學(xué)的成功實(shí)施有賴于對(duì)擬修復(fù)器官在特定情況下特異基因表達(dá)的充分了解，對(duì)該分子網(wǎng)絡(luò)的了解有助于我們?nèi)斯ば纬纱龠M(jìn)該組織再生的微環(huán)境。而激光顯微切割(Laserm icrodissection，LMD)技術(shù)是近幾年興起的用于精確分離目標(biāo)組織或細(xì)胞的高新技術(shù)，它能在顯微鏡高倍視野下觀察到特異性組織和細(xì)胞，再利用激光束對(duì)目標(biāo)組織/細(xì)胞進(jìn)行切割分離，這對(duì)于解決“細(xì)胞/組織異質(zhì)性”問題發(fā)揮了重要作用。

LMD對(duì)組織切片的要求：(1)保持足夠的組織成分完整度，以供下游實(shí)驗(yàn)分析；(2)形態(tài)學(xué)辨認(rèn)清楚，保證目標(biāo)組織被精確識(shí)別。

針對(duì)第一點(diǎn)，如僅需提取組織中的蛋白質(zhì)，則長期保存的石蠟切片也有可能獲得成功。但如果所需提取的是樣品中最易降解的RNA，則冰凍切片無疑是首選的取材方式。而為了實(shí)現(xiàn)保護(hù)組織，有研究者甚至動(dòng)用了在LMD系統(tǒng)上加裝真空或惰性氣體保護(hù)取材區(qū)的復(fù)雜方式[9]。如果沒有這些非常規(guī)手段，只有結(jié)合所使用切割系統(tǒng)的特點(diǎn)，綜合設(shè)計(jì)，優(yōu)化整個(gè)取材流程，目的就是——減少目標(biāo)組織在落入裂解液前的非保護(hù)狀態(tài)下的暴露時(shí)間，一般文獻(xiàn)建議在15-20m in內(nèi)完成LMD切割[7,9]。如以本次實(shí)驗(yàn)切割早期礦化的牙胚組織為例，配合LMD6000切割系統(tǒng)的單人操作樣品數(shù)以三枚樣品為一組較為適宜。在冰凍切片完成后，立即轉(zhuǎn)入LMD切割，三枚樣品分離完畢，立即收集裂解液，凍存于-70度冰箱保存。

針對(duì)第二點(diǎn)，如果組織的形態(tài)學(xué)鑒別非常困難，一般通過染色的方式加以克服。但由于常規(guī)的染色過程處于親水狀態(tài)，在較長時(shí)間的染色過程中易造成RNase對(duì)細(xì)胞RNA的降解。如果經(jīng)費(fèi)充裕又追求切割時(shí)形態(tài)辨認(rèn)的絕對(duì)精確性，可以購買價(jià)格不菲的專用染色試劑盒產(chǎn)品，據(jù)廠家宣傳可以保持染色及切割過程中RNA完整性。也有學(xué)者使用自制的以乙醇為溶劑的染色劑，來盡量避免接觸親水過程[11]。在本研究中的前期實(shí)驗(yàn)中，作者首先設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)明確了常規(guī)染色對(duì)樣品完整性的破壞，即使以DEPC水配制染色劑，以期盡可能消除染料中的RNase，染色過程依然會(huì)對(duì)樣品的完整性造成較大破壞；再經(jīng)過反復(fù)多次染色練習(xí)，熟悉光鏡下組織結(jié)構(gòu)，基本實(shí)現(xiàn)了在鏡下無需染色直接觀察區(qū)分牙囊結(jié)構(gòu)。對(duì)于難以區(qū)分的樣品，一般做舍棄處理或僅染色普通光鏡切片以輔助識(shí)別，節(jié)約了染色步驟所需時(shí)間和避免了親水環(huán)境對(duì)組織的降解。研究認(rèn)為內(nèi)源性RNA酶的作用離不開細(xì)胞內(nèi)的親水環(huán)境，因此本實(shí)驗(yàn)比較了兩種乙醇處理方式：100%乙醇處理和梯度乙醇脫水對(duì)于保護(hù)激光切割前組織RNA的完整度的差異，結(jié)果顯示前者更具優(yōu)勢(shì)。推測可能與該步驟簡單節(jié)約操作時(shí)間以及整個(gè)步驟未再創(chuàng)造親水環(huán)境從而抑制了細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶的作用有關(guān)。

完整和均一是評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量的最關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)，也是下游生物學(xué)分析尤其是基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)和保障。最為常用的RNA完整度鑒定方法是瓊脂糖凝膠電泳，但其缺點(diǎn)是對(duì)RNA用量要求較高，至少200ng以上，因而無法檢測微量RNA。從顯微切割而來RNA的特點(diǎn)就是量非常少而寶貴，目前較為先進(jìn)的方法還是以安捷倫公司的生物分析儀2100為首選，能夠分析ng級(jí)的RNA[12]。文獻(xiàn)上多數(shù)以其自帶的RIN值為討論依據(jù)，一般為大于7.0至8.0為標(biāo)準(zhǔn)，輔以rRNA的28s/18s的比值，以1.8-2.0附近為佳，過高或過低都不好。另外還需依據(jù)電泳圖波形，即peak pattern來判斷是否有基因組DNA殘留。本研究結(jié)果提示，分析樣品降解程度應(yīng)綜合上述三項(xiàng)指標(biāo)，尤其是樣本量較小的時(shí)候，單一指標(biāo)可能并不能充分反應(yīng)樣品降解程度。

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