徐 普 朱亞麗 劉德裕 李曉敏 毛小泉 吳 卉 程亞楠

人體自身血液制品在促進(jìn)愈合方面的研究很多，在口腔種植臨床的應(yīng)用也越來越受到大家的關(guān)注[1-4]。富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)為第二代的血小板凝集物，是具有粘性的富含高濃度纖維蛋白原及多種生長因子的血小板凝膠。有研究認(rèn)為，以纖維蛋白為基礎(chǔ)的白細(xì)胞與血小板凝集物能促進(jìn)頭面部的成骨細(xì)胞生長，從而促進(jìn)硬組織的愈合[5]。

有研究顯示，PRF在口腔種植手術(shù)后能加快硬組織的改建速度[6-7]，但PRF單獨(dú)應(yīng)用于動物的種植實驗研究，尤其是即刻種植即刻負(fù)重中使用PRF的研究，國內(nèi)至今未見報道。本研究將PRF引入口腔即刻種植即刻負(fù)重中，通過動物實驗的方法描述其修復(fù)硬組織的情況，以指導(dǎo)進(jìn)一步的動物實驗研究和臨床應(yīng)用。

1.材料與方法

1.1主要儀器與材料 種植機(jī)(Nobel，奧地利)；便攜式X射線機(jī)(ADX 4000，韓國)；臺式低速離心機(jī)(TD4Z-WS，長沙)；柱形螺紋純鈦種植體(Osstem，韓國4×10mm，共10支)。

1.2實驗對象 健康純種雄性beagle犬(沈陽康平實驗動物研究所提供)5只，體重約13-16kg，年齡為24個月。要求牙體、牙列完整，無牙體牙周疾病，咬合關(guān)系正常。所有實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)一個月后進(jìn)行實驗。

1.3 PRF制備方法 術(shù)前用頭皮針從實驗動物下肢小隱靜脈抽取10m l血液放入10m l離心管中，并立即置于低速離心機(jī)中以3000rpm/m in，經(jīng)10m in離心后備用。

1.4實驗方法

1.4.1動物模型制備 在30g/L戊巴比妥鈉溶液靜脈麻醉下，拔除5只beagle犬雙側(cè)下頜第四前磨牙(PM 4)，立即常規(guī)植入種植體。使種植體頸部與牙槽窩邊緣骨嵴平齊，并旋入牙齦成形器以形成即刻負(fù)重，必要時對牙齦成形器進(jìn)行調(diào)磨消除咬合高點。

1.4.2缺損制備標(biāo)準(zhǔn) 采用自身對照方式，每只犬采用隨機(jī)法區(qū)分對照側(cè)與實驗側(cè)，用骨鑿在種植體頰側(cè)制備約4mm×5mm缺損，暴露種植體上部(圖1)；制備實驗側(cè)牙槽間隔約3mm×3mm缺損，對照側(cè)牙槽間隔處不制備缺損。實驗組采用PRF填塞種植體頰側(cè)缺損，遠(yuǎn)中間隔缺損和拔牙窩；對照組種植體頰側(cè)缺損僅以出血形成的血凝塊充填，間隔不制備缺損，拔牙窩用明膠海綿填塞，可吸收縫線關(guān)閉創(chuàng)口。

1.4.3取材及HE切片制作 3個月后手術(shù)切開觀察骨缺損位置新骨形成情況，并測量記錄，同時在雙側(cè)種植體頰側(cè)缺損修復(fù)區(qū)、間隔和拔牙窩骨質(zhì)處取材，常規(guī)制作骨組織HE切片并在光鏡下觀察，并對骨組織中成骨細(xì)胞多少和骨基質(zhì)的礦化程度做出基本判斷。

1.5統(tǒng)計方法 本實驗使用SPSS17.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示，各組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1缺損處骨量的變化 實驗組遠(yuǎn)中拔牙窩及牙槽間隔骨已與周圍骨面平齊，種植體頰側(cè)已由原來的矩形缺損變?yōu)榈谷切稳睋p，骨的生成量不等(圖1，圖2)。對照組遠(yuǎn)中拔牙窩骨組織與周圍骨面平齊，種植體頰側(cè)矩形骨缺損也有部分骨組織生成。以種植體頸緣近、遠(yuǎn)中骨嵴最高處連線(種植體頸緣)為標(biāo)記線，記錄PRF置入當(dāng)時及三個月后頰側(cè)骨缺損最低點至標(biāo)記線的垂直距離，以確定頰側(cè)骨缺損的高度的變化，計算出骨增加的高度和余留骨缺損的面積(圖3)。

圖1 2號犬實驗頰側(cè)即刻種植后(箭頭示骨缺損區(qū))

圖2 2號犬實驗頰側(cè)即刻種植后3個月(牙齦成形器已取下，箭頭示骨缺損已基本恢復(fù))

圖3 頰側(cè)骨缺損最低點至標(biāo)記線(a)的垂直距離(b)

表1顯示3個月后種植體頰側(cè)缺損處新生骨質(zhì)的高度和面積。因為第二只動物實驗組種植體脫落，所以統(tǒng)計時沒有第二只動物實驗組的數(shù)據(jù)。本研究為小樣本資料，實驗組頰側(cè)新生骨高度平均為2.60mm，對照組為1.60mm，P<0.05(表1)；實驗組頰側(cè)余留骨缺損面積平均為1.45mm2，對照組3.00mm2，P<0.05(表2)。兩組數(shù)據(jù)差異都有統(tǒng)計學(xué)意義。可以認(rèn)為，實驗組骨組織增加的高度多于對照組，余留缺損面積小于對照組，即PRF有利于骨組織的生成。

表1 3個月后種植體頰側(cè)缺損骨增加高度(mm)

表2 3個月后骨缺損區(qū)的面積比較(mm2)

2.2骨組織切片觀察結(jié)果

2.2.1頰側(cè)新生骨組織 種植體植入3個月后種植體頰側(cè)骨組織切片觀察，實驗組(圖4)可見大量血管、成骨細(xì)胞和礦化程度不等的骨組織生成，骨小梁致密；對照組(圖5)也可見血管，成骨細(xì)胞和礦化程度不等的骨組織生成，但是成骨細(xì)胞的數(shù)量比實驗組略少。

圖4 3號犬實驗組種植體頰側(cè)骨(HE染色×100)

圖5 3號犬對照組種植體頰側(cè)骨(HE染色×100)

2.2.2遠(yuǎn)中拔牙窩新生骨組織 觀察種植體植入3個月后種植體遠(yuǎn)中拔牙窩骨組織切片，實驗組可見大量血管、成骨細(xì)胞和礦化程度不等的骨組織生成，骨小梁致密(圖6)；對照組血管明顯比實驗組少，也有成骨細(xì)胞和礦化程度不等的骨組織，但成骨細(xì)胞的數(shù)量比實驗組略少(圖7)。

圖6 5號犬實驗組原遠(yuǎn)中拔牙窩骨(HE染色×100)

圖7 5號犬對照組原遠(yuǎn)中拔牙窩骨(HE染色×100)

2.2.3牙槽間隔新生骨組織 觀察種植體植入3個月后種植體遠(yuǎn)中牙槽間隔骨組織切片，實驗組(圖8)可見大量血管、成骨細(xì)胞和礦化程度不等的骨組織生成，骨小梁致密粗大，與對照組正常骨組織(圖9)無明顯差別。

圖8 2號犬實驗組新生牙槽間隔骨(HE染色×100)

圖9 2號犬對照組正常牙槽間隔骨(HE染色×100)

3.討論

富血小板纖維蛋白(PRF)為第二代的血小板凝集物，是具有粘性的富含高濃度纖維蛋白原及各種生長因子的血小板膠，與第一代血小板凝集物富血小板血漿(PRP)最大的不同是PRF制備簡單快捷，不需要添加任何人工的生物化學(xué)試劑[7]。本研究制備的PRF凝膠在鹽水紗布上，可擠壓成有一定形狀的彈性薄膜，根據(jù)需要修剪成小塊；而PRP只能形成凝膠而不能壓縮成膜，這就是PRP不能單獨(dú)作為骨的修復(fù)材料使用，而PRF可以單獨(dú)作為骨修復(fù)材料的原因[8]。

在骨組織的愈合中，血凝塊要為各種成骨相關(guān)的細(xì)胞提供增殖分化的場所，所以其形成至關(guān)重要。PRF中的纖維蛋白網(wǎng)架結(jié)構(gòu)與血凝塊內(nèi)的纖維蛋白的結(jié)構(gòu)極其相似，有序、致密，數(shù)量豐富，并含大量的白細(xì)胞和多種生長因子，因此，PRF中的纖維蛋白網(wǎng)不但為骨缺損區(qū)提供了類似凝血塊的網(wǎng)格支架功能，其中的大量白細(xì)胞增強(qiáng)PRF抗炎能力，同時其多種生長因子還可促進(jìn)骨缺損區(qū)的生長與愈合[9,10]。大體觀察發(fā)現(xiàn)，種植3個月后實驗組新生骨的生成能力、改建和重塑能力強(qiáng)于對照組(圖1，圖2；表1，表2)；而組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，種植體頰側(cè)和遠(yuǎn)中拔牙窩實驗組比對照組成骨細(xì)胞要多，但骨組織的成熟度相差不大(圖3-圖6)，和正常骨組織也沒有明顯區(qū)別(圖7，圖8)，即PRF的作用主要體現(xiàn)在量的優(yōu)勢。

PRF的作用時間為7-11天，長于第一代血小板凝集物富血小板血漿(PRP)的3-5天，且作用穩(wěn)定。PRF主要是早期促進(jìn)成骨作用，即在成骨的早期，持續(xù)釋放大量細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、血小板源性生長因子(PDGFs)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等[11,12]，增加了實驗組成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的數(shù)量和活性，促進(jìn)血管的生成等。

在這些因子中TGF-β 作為趨化因子可以在種植床周圍吸附大量骨母細(xì)胞，刺激成骨細(xì)胞的增殖，增加骨細(xì)胞的數(shù)量，抑制破骨細(xì)胞的形成；促進(jìn)成骨細(xì)胞基質(zhì)的沉積和成纖維細(xì)胞基質(zhì)的形成。PDGF不僅可刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞的有絲分裂以增加骨細(xì)胞的數(shù)量，還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)種植區(qū)毛細(xì)血管的生長，使成骨細(xì)胞趨化增殖并增加膠原蛋白合成的能力。IGF不僅刺激成骨細(xì)胞和前成骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨和骨基質(zhì)形成，還可通過介導(dǎo)作用調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化形成及功能活性，在骨改建耦聯(lián)中發(fā)揮重要作用。而后期的愈合則有賴于成骨細(xì)胞的自分泌成骨相關(guān)的生長因子，以及受趨化后增殖的以及血管來源的生長因子。對照組早期便只有血液來源的生長因子和巨噬細(xì)胞分泌生長因子，在生長因子的質(zhì)和量上都遜于實驗組，因此其骨生長的量明顯小于實驗組(表1，表2)。

雖然血小板及其釋放的生長因子在PRF的生物學(xué)上發(fā)揮了重要的作用，但對其治療潛能起到?jīng)Q定性的作用還是纖維蛋白基質(zhì)[13]。PRF中的纖維蛋白網(wǎng)的存在使得這些細(xì)胞因子在PRF的降解過程中能逐步緩慢釋放，并為修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞提供了增殖分化的場所，在組織修復(fù)過程中發(fā)揮了細(xì)胞支架的作用[14]，而且纖維蛋白基質(zhì)是促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞移植最適合的基質(zhì)載體[15]。纖維蛋白也可以促進(jìn)新生血管形成，促進(jìn)血液里未分化的間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變，形成骨組織。這也是本研究中對照組骨生長的量明顯小于實驗組的又一原因。

綜上所述，PRF的應(yīng)用能夠有效恢復(fù)種植體頰側(cè)的骨缺損，表明PRF可以單獨(dú)作為骨充填材料修復(fù)種植體周圍骨缺損；種植體遠(yuǎn)中骨缺損修復(fù)情況表明，PRF作為獨(dú)立的骨充填材料修復(fù)的新骨與正常骨無明顯差異；在拔牙窩處加入PRF或明膠海綿[16]，均可促進(jìn)拔牙創(chuàng)軟硬組織的愈合，但PRF促進(jìn)骨形成效果更佳。

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