李秋紅，楊柳，吳瑩，葛越，李天英

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

水飛薊賓(silibinin)來源于菊科植物水飛薊(Silybum marianum)果實，為黃酮木脂素類化合物，具有明顯抗氧化、抗炎、保護(hù)肝細(xì)胞、促進(jìn)肝細(xì)胞再生的作用，臨床上作為保肝藥物長期應(yīng)用［1－2］。在臨床上主要應(yīng)用片劑、膠囊劑，但其具有難溶性，且生物利用度低，吸收不穩(wěn)定，從而影響臨床療效，故近年來提高水飛薊賓生物利用度的制劑研究較多［3］，不斷有新的劑型推出［4－6］。水飛薊賓葡甲胺鹽凍干粉末作為水飛薊賓注射劑處于研制階段［7］，做為注射劑使用可以提高其生物利用度。

水飛薊賓葡甲胺鹽作為注射劑在犬體內(nèi)有研究［8］，但其藥物動力學(xué)研究尚未見報道。本文針對靜脈注射水飛薊賓葡甲胺鹽后大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程及其在組織中的分布進(jìn)行研究，為水飛薊賓葡甲胺鹽注射劑的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(LC－2010，日本島津，UV檢測器，Class－vp色譜工作站);氮吹儀(KL512型，北京);旋渦混合器(XW－80A，上海);高速冷凍離心機(TGL16M，長沙);超濾離心管(Millipore，美國);水飛薊賓對照品(常州龍騰生物科技有限公司，批號20051103);水飛薊賓葡甲胺鹽(常州龍騰生物科技有限公司，批號20030201);其它試劑均為市售色譜純、分析純;水為超純水。

1．2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil(R)C18柱(250mm ×4.6mm，北京迪馬公司)，流動相:乙腈:0.3%磷酸水(47∶53，v:v)，流速:0.8mL/min，柱溫:30℃，檢測波長:288nm。

1．3 動物實驗

清潔級雄性 Wistar大鼠，12～14周齡，體質(zhì)量370～420g(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，SYXK(黑)2008－001提供)。大鼠麻醉后，施行靜脈插管，快速靜脈注射水飛薊賓葡甲胺鹽注射液(按照人體高、中、低劑量等效量折算相應(yīng)劑量為6．25、12.5、25mg/kg，由于水飛薊賓葡甲胺鹽注射劑并未在臨床上應(yīng)用，無市售。故使用前需配制)，給藥后于3、5、10、20、30、40、60、80、100、120min 采集血液樣品200μL，立即離心分離得血漿。整個實驗過程中，用電熱毯保持大鼠體溫，直至實驗結(jié)束。另取鼠，在高劑量給藥后，分別于 30、60、90、120、180、240min 斷頭處死動物，取心、肝、脾、肺、腎，剔除結(jié)締組織，稱重。

1．4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取水飛薊賓葡甲胺鹽對照品，加甲醇溶解，配制成1.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20℃下保存待用。臨用時以甲醇為溶劑逐級稀釋，得到所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1．5 樣品的處理

1．5．1 血漿樣品的處理

精密移取各個采集時間點的含藥血漿100μL，向每只試管中加入叔丁基甲醚1mL，渦旋混合1min，離心10min(3000r/min)，取上清液0.7mL，50℃水浴下氮氣吹干，用200μL的流動相溶解混合，取20μL進(jìn)樣分析。

另取500μL血漿樣品置于超濾離心管中，冷凍離心40min(10000r/min)，取濾液，加入甲醇1mL后按上述方法進(jìn)行操作，進(jìn)樣20μL，HPLC分析。

1．5．2 組織樣品處理

取大鼠心、肝、脾、肺、腎稱量約0.5g，剪碎，加入1mL生理鹽水，用勻漿機以5000r/min制成均勻的組織勻漿。取上清液400μL，加入2mL叔丁基甲醚，渦旋混合5 min后，4000r/min離心10min。取上層液，40℃氮氣吹干，殘渣加200μL甲醇使其溶解，再次渦旋，冷凍離心10min后，取上清液20μL進(jìn)樣分析。

1．6 數(shù)據(jù)分析

以測得血藥濃度繪制藥時曲線，根據(jù)AIC法判別隔室模型，血漿濃度(C)－時間(t)數(shù)據(jù)依下公式解析:

Cp=Ae－at+Be－βt，A、B、α 及 β 為混雜參數(shù)。

用藥動學(xué)軟件3P97程序進(jìn)行主要藥動學(xué)參數(shù)A、B，α、β、AUC、CL、K10等的計算，用下列公式計算藥物與血漿的蛋白結(jié)合率。各實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以(±s)表示。

2 結(jié)果

2．1 方法學(xué)考察結(jié)果

2．1．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密加入水飛薊賓葡甲胺鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于100μL空白血漿及400μL組織勻漿中，配制濃度分別為10.0、50.0、100.0、300.0、500.0、700.0μg/mL 的血漿標(biāo)準(zhǔn)系列及濃度分別為 0.1，0.5，1，2，5，10μg/mL 的各組織標(biāo)準(zhǔn)系列，按樣品處理方法操作，在HPLC測定條件下，測水飛薊賓葡甲胺鹽峰面積，對峰面積的值(y)和濃度(x)進(jìn)行回歸，得到水飛薊賓葡甲胺鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:血漿 y=5364x－6080.6，r=0.9992;心 y=29501x+6407，r=0.9989;肝 y=29359x+7194.7，r=0.9998;脾 y=29259x+24820，r=0.9971;肺 y=28166x+5571.2，r=0.9992;腎 y=29028x+11746，r=0.9990。分別在10～700μg/mL濃度范圍內(nèi)及0.1～10μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限分別為10μg/mL及0.1μg/mL。

2．1．2 方法特異性考察

按照上述色譜條件和血樣處理方法，分別將空白血漿、樣品血漿和空白血漿加對照品經(jīng)血樣處理步驟操作后進(jìn)樣分析，所得色譜圖如圖1所示。

圖1 樣品色譜圖

由圖1可見，在上述色譜條件下，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對水飛薊賓葡甲胺鹽的測定在出峰位置沒有干擾，因此本方法具有良好的專屬性。在各組織樣品中，水飛薊賓葡甲胺峰處無雜峰干擾，特異性好。

2．1．3 精密度和回收率實驗

精密移取一定體積的水飛薊賓葡甲胺鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于100μL空白血漿和組織勻漿中，配成低、中、高三個濃度(血漿濃度為 10，100，700μg/mL，組織濃度為0.1，1，10μg/mL)的血漿樣品和各組織樣品，按樣品處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析，用當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算回收率。低、中、高三種濃度的血漿及組織樣品中方法回收率分別在97.94%～104.19%和91.23% ～105.91%之間，日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于10%。

2．1．4 穩(wěn)定性考察

取低、中、高三個濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，進(jìn)行穩(wěn)定性的考察。實驗結(jié)果表明，樣品處理流動相復(fù)溶及樣品放置在－20℃冷凍保存后反復(fù)融化、冷凍，穩(wěn)定性均良好(RSD＜5%)。

2．2 藥動學(xué)結(jié)果

靜脈注射高、中、低劑量水飛薊賓葡甲胺鹽后，水飛薊賓葡甲胺鹽血藥濃度－時間曲線(見圖2);根據(jù)藥時曲線結(jié)果，經(jīng)3P97軟件計算，得出主要藥動學(xué)參數(shù)(見表1)。

圖2 高、中、低劑量給藥后水飛薊賓葡甲胺鹽血藥濃度－時間曲線

表1 水飛薊賓葡甲胺鹽表藥動學(xué)參數(shù)(n=5，±s)

表1 水飛薊賓葡甲胺鹽表藥動學(xué)參數(shù)(n=5，±s)

0．314 ±0．03 0．42 ±0．05 0．588 ±0．07 β(min－1)0．025 ±0．001 0．050 ±0．002 0．050 ±0．007 t1/2α(min)2．201 ±0．091 0．877 ±0．090 1．177 ±0．031 t1/2β(min)27．110 ±0．50013．829 ±0．21211．526 ±0．901 AUC(μg/mL/min)1868．671 ±25 1427．284 ±16 452．248 ±152 K10(min －1)0．018 ±0．01 0．0286 ±0．02 0．033 ±0．037 CL(mL/min)0．026 ±0．001 0．041 ±0．002 0．037 ±0．004 t1/2(min)ParametersHigh－doseMedium－doseLow－dose α(min－1)38．06103 ±0．524．14802 ±0．3 20．6409 ±0．8

通過中、低劑量給藥后水飛薊賓葡甲胺鹽藥動學(xué)參數(shù)對比發(fā)現(xiàn)，AUC隨劑量增加而成比例增加，t1/2無顯著性差異，說明在此劑量范圍內(nèi)水飛薊賓葡甲胺鹽的消除為線性消除;而高、中劑量給藥后AUC不成比例將使血藥濃度與之不成比例的升高或下降。t1/2顯著延長，表明水飛薊賓葡甲胺鹽在高劑量范圍內(nèi)大鼠體內(nèi)消除過程呈現(xiàn)非線性動力學(xué)特征，劑量微小變化。

2．3 血漿蛋白結(jié)合率測定結(jié)果

經(jīng)超濾法測定高、中、低劑量靜脈注射給藥后水飛薊賓葡甲胺鹽的蛋白結(jié)合率，結(jié)果分別為:高劑量:(70.53±0.01)%;中劑量:(72.02±0.02)%;低劑量:(73.43±0.01)%，測定結(jié)果不隨劑量的變化而變化(P＞0.05)。

2．4 組織分布結(jié)果

由實驗結(jié)果可知，高劑量的注射用水飛薊賓葡甲胺在大鼠體內(nèi)的各個組織都有一定量的分布，在體內(nèi)分布的最高濃度的大小順序為肺、肝、心、腎、脾。由實驗結(jié)果可以看出，注射用水飛薊賓葡甲胺鹽在各組織中的濃度在肺內(nèi)的濃度較大，并且在60min附近藥物濃度達(dá)到最大值(1.46μg/mL);其次是肝臟，是在60min達(dá)到最高的藥物濃度。而腎臟與脾臟均是在90min達(dá)到藥物濃度最高點，心臟是在30min達(dá)到最高的藥物濃度。隨著時間的推移，各個組織器官中水飛薊賓葡甲胺鹽的含量迅速下降，到180min后，水飛薊賓葡甲胺鹽在各個組織器官的含量比較低，并且各個組織中水飛薊賓葡甲胺鹽含量沒有明顯的差別。

圖3 高劑量給藥后水飛薊賓葡甲胺鹽組織分布曲線(n=5，±s)橫坐標(biāo)為t/min，縱坐標(biāo)為logC(μg/mL)

3 討論

3．1 由于水飛薊賓葡甲胺鹽其水溶性仍然很差，所以注射劑的制備過程中加入增溶劑［8］。本實驗嘗試使用了丙二醇、無水乙醇、PEG400來增加水飛薊賓葡甲胺鹽的水溶性。結(jié)果顯示，使用丙二醇的的增溶效果要好于無水乙醇、PEG400，所以本實驗應(yīng)用丙二醇增溶。

3．2 高、中、低劑量下的AUC除以其相應(yīng)劑量所得的比值(84.72、114.16、72.32)經(jīng)數(shù)理統(tǒng)計t檢驗具有顯著差異(P＜0.05)，這表明注射用水飛薊賓葡甲胺鹽在大鼠體內(nèi)的消除過程呈非線性動力學(xué)特點。非線性速度過程的產(chǎn)生，通常是由于藥物的體內(nèi)過程有酶和載體的參與，或是藥物與血漿蛋白結(jié)合達(dá)飽和。本實驗中，高、中、低劑量下血漿蛋白結(jié)合率均在70%左右(是一種蛋白結(jié)合率非劑量依賴性藥物)，推斷非線性藥動學(xué)過程不是由結(jié)合蛋白飽和引起的，產(chǎn)生非線性藥動學(xué)過程的具體機制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

3．3 由圖3可知，心臟、肝臟與肺臟的藥－時曲線比較尖銳，而脾臟與腎臟的藥時曲線比較平緩。以腎臟的藥時曲線可以看到，在60min和90min的藥物濃度比較接近，證明水飛薊賓葡甲胺鹽在腎臟的代謝是比較緩慢的。并且肝臟的藥－時曲線在180min時，出現(xiàn)一個比較小的藥物濃度峰，分析原因可能是肝中的某種代謝酶致使肝臟中代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化所致，但具體機制有待進(jìn)一步研究。由以上實驗結(jié)果可知，水飛薊賓葡甲胺鹽在肺臟中分布較多，在劑型研究過程中應(yīng)考慮通過某些方式來改變其體內(nèi)分布，使藥物在肝臟中有更多的分布，使藥物發(fā)揮更強大的藥理作用。

本實驗首次應(yīng)用HPLC法來研究注射用水飛薊賓葡甲胺鹽在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程，通過不同劑量給藥后藥動學(xué)參數(shù)的比較，明確水飛薊賓葡甲胺鹽在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)過程。與以往的口服給藥相比較，靜脈注射給藥克服了其吸收差、生物利用度低的缺點，可見該劑型具有很大的研究價值及市場潛力。

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