劉海洋，路瑞華，李偉，王加志

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007;2黑龍江省中醫(yī)研究院，黑龍江 哈爾濱 150036)

離體肝灌流技術(shù)最初由英國生理學(xué)家Trowell［1］于1942年創(chuàng)立，1951年Miller［2］改進(jìn)了灌流方法。近年來，離體肝灌流(ILP)技術(shù)被廣泛用于藥理毒理學(xué)研究，在進(jìn)行離體肝灌流實(shí)驗(yàn)時(shí)，灌流液中的藥物未經(jīng)腸道菌群代謝、消化酶及消化道上皮細(xì)胞的影響，化合物均以原形存在于灌流液中，直接與肝細(xì)胞相接觸產(chǎn)生作用，排除體內(nèi)其他細(xì)胞因子、激素等的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 藥物與試劑

受試藥物購于黑龍江省藥材公司，黃藥子產(chǎn)地河北，經(jīng)黑龍江省藥檢所鑒定為薯蕷科植物黃獨(dú)(Dioscorea bulbifera L)的塊莖。當(dāng)歸產(chǎn)地四川，經(jīng)黑龍江省藥檢所鑒定本品為傘形科植物當(dāng)歸(Angelica sinensis(Oliv．)Diels)的干燥根。

黃嘌呤氧化酶測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，20100929);ALT(長春匯力生物技術(shù)有限公司，2010042)。

供試溶液的制備:黃藥子、當(dāng)歸飲片，頭煎10倍量水，浸泡2h后，煎煮1h，二煎8倍量水，煎煮1h，合并煎液，濃縮為含黃藥子0.44g/ml;當(dāng)歸0.88g/ml。并分別以相同條件制備黃藥子配伍當(dāng)歸水煎液，1∶2配伍組1.32g/ml。

乳酸鈉林格氏液(天津市大冢制藥有限公司，8J79C);1640(德國貝爾);醫(yī)用氧氣(純度大于99%，黑龍江佳木斯醫(yī)用氣體公司);EDTA(上海華舜生物工程有限公司);磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碳酸氫鈉、葡萄糖(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，GR)。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠，50只，體質(zhì)量(250±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評(píng)價(jià)中心(GLP)提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證書號(hào):醫(yī)動(dòng)字第01－10－2號(hào)。

1．3 Krebs－Ringer灌流液的配制

取市售的乳酸鈉林格氏液1000ml，加入碳酸氫鈉2100.25mg、EDTA－Na2186.12mg、葡萄糖 2199.68mg、磷酸二氫鉀163.31mg、硫酸鎂295.78mg，超聲溶解，即得，4℃保存，臨用前預(yù)熱至37℃。

1．4 儀器

恒流泵(河北保定蘭格恒流泵有限公司BQ50－1J，泵頭WX10);752型分光光度計(jì)(上海第二分析儀器廠);電子pH計(jì)(上?？祪x儀器有限公司PHB－8型);水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司，DK－98－1型，加熱功率500W加熱溫度37～100℃，波動(dòng)度±5℃)。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 方法與結(jié)果

2．1 最佳灌流條件考查

以經(jīng)氧氣飽和及加熱至37℃的灌流液非循環(huán)性灌流沖洗肝臟中的血液。分別以不同流速進(jìn)行灌流，同時(shí)測(cè)定流出液pH值及ALT酶活性。見表1、表2。

表1 不同流量下各灌流組流出液的pH值變化情況(±s)

表1 不同流量下各灌流組流出液的pH值變化情況(±s)

注:高流速組與中低流速組相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。使用中低流速灌流過程中，pH值相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)肝組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本無損傷。

時(shí)間n最高15' 5 7．51 ±0．01 7．52 ±0．02 7．02 ±0．02 7．05 ±0．03流量低中高30' 5 7．53 ±0．01 7．49 ±0．02 6．73 ±0．02* 6．55 ±0．00460' 5 7．53 ±0．01 7．49 ±0．01 6．56 ±0．02 6．00 ±0．0390' 5 7．44 ±0．01 7．45 ±0．02 6．04 ±0．02 5．57 ±0．06＊＊

表2 不同灌流速度下各組流出液中ALT酶活性(U/L，±s)

表2 不同灌流速度下各組流出液中ALT酶活性(U/L，±s)

注:各流速組相比，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。以高流速灌流，在90分鐘內(nèi)，受試肝臟產(chǎn)生明顯損害，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別90中 5 33．55 ±5．76 35．24 ±5．36 39．14 ±5．67 44．85 ±4．57高 5 41．24 ±3．67 51．94 ±4．67*65．24 ±7．67* 69．26 ±7．97*最高 5 52．49 ±3．81＊＊63．24 ±5．83＊＊67．34 ±8．97＊＊ 71．41 ±12．67 n15' 30' 60' 90'低 5 34．57 ±5．18 34．36 ±4．21 38．26 ±5．17 41．29 ±3．＊＊

灌流90min后，中流量組肝臟外觀呈土黃色，顏色均一，質(zhì)柔軟，無腫脹且在整個(gè)灌流過程中流出液pH值保持相對(duì)恒定，最適宜肝灌流研究。

2．2 離體肝灌流

離體大鼠肝灌流模型建立參照丁選勝的方法［3］。

2．3 取樣時(shí)間

給藥前為 0，給藥后 15'、30'、60'、90'分別取樣0.5ml，立即補(bǔ)入相應(yīng)劑量的1640灌流液。

2．4 黃嘌呤氧化酶(XOD)測(cè)定方法按試劑盒說明

取樣品0．1ml，加入各種試劑，混勻，置37℃水浴20min，加終止液1mL，混勻，于530nm，1cm 光徑，以蒸餾水調(diào)吸光度零點(diǎn)，用752分光光度計(jì)讀取各管的OD值。

2．5 結(jié)果

2．5．1 黃藥子單煎液對(duì)大鼠灌流肝臟XOD活性的影響

取大鼠30只，隨機(jī)分為三組，分別為高劑量組(4．4mg/ml)、中劑量組(2．2mg/ml)、低劑量組(1.1mg/ml)。結(jié)果見表3。黃藥子單煎組不同劑量下酶活性相比較，XOD活性差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃藥子單煎液在低劑量時(shí)即可產(chǎn)生肝毒性，隨著作用時(shí)間的延長，損傷作用更加明顯。

表3 黃藥子單煎液對(duì)大鼠灌流肝臟XOD活性的影響(±s)

表3 黃藥子單煎液對(duì)大鼠灌流肝臟XOD活性的影響(±s)

注:高、中、低各劑量組各時(shí)間點(diǎn) XOD 活性比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

15' 30' 60' 90'低劑量 10 3．01 ±0．51 10．15 ±3．32 15．29 ±2．59 16．67 ±4．72 19．08 ±5．49組別n 0*中劑量 10 3．10 ±1．01 11．27 ±4．21 16．60 ±5．28 19．37 ±3．27 27．65 ±5．51＊＊高劑量 10 3．00 ±0．87 12．65 ±3．94 17．98 ±3．25 23．56 ±3．49 38．55 ±6．30＊＊

2．5．2 黃藥子與當(dāng)歸配伍混煎液對(duì)大鼠灌流肝臟XOD活性的影響 結(jié)果見表4。

表4 配伍混煎液對(duì)大鼠灌流肝臟XOD活性的影響(±s)

表4 配伍混煎液對(duì)大鼠灌流肝臟XOD活性的影響(±s)

注:配伍組與空白組相比較，*P＞0．05;配伍組與黃藥子組灌流30'－90'的酶活性比較，△P＜0．05;說明黃藥子與當(dāng)歸1∶2為減毒最佳配伍比例，具有保護(hù)肝細(xì)胞、降低肝損傷的作用。

n15' 30' 60' 90'配伍組 10 7．34 ±3．87* 9．25 ±3．23 10．54 ±2．82 11．48 ±2．23組別△黃單組 1010．15 ±3．32 15．29 ±2．59 16．67 ±4．72 19．08 ±5．49△空白組 10 6．89 ±1．72* 6．96 ±1．91 6．99 ±3．31 6．87 ±4．18△

2．5．3 灌流肝臟病理組織切片的光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果見圖1。

圖1 灌流肝臟HE染色光學(xué)顯微鏡圖

由圖可知，空白組肝細(xì)胞索排列整齊，胞質(zhì)染色均一，中央靜脈結(jié)構(gòu)清晰;黃藥子組肝細(xì)胞腫脹溶合、排列紊亂、肝板消失、細(xì)胞界限不清、細(xì)胞核固縮、胞漿染色不均一、匯管區(qū)空泡變，小膽管擴(kuò)張、水腫、并有大量炎癥細(xì)胞浸潤和脂肪滴形成。配伍組肝板沿中央靜脈輻射狀排列，肝板與肝血竇較清晰，病變呈局灶性，肝細(xì)胞個(gè)別出現(xiàn)腫脹及炎細(xì)胞浸潤。

3 討論

黃嘌呤氧化酶(XOD)是體內(nèi)核酸代謝中一種重要的酶，其廣泛分布于心、肺、肝臟、小腸粘膜等組織細(xì)胞漿膜內(nèi)，血清中的 XOD主要來自于肝細(xì)胞，可反映肝細(xì)胞損傷且有特異性診斷意義［4］。肝組織內(nèi)氧自由基增加愈明顯，XOD活性明顯降低，脂質(zhì)過氧化物生成明顯增加，對(duì)肝組織的損傷也越重。

超氧陰離子自由基的生成與黃嘌呤氧化酶活性呈正相關(guān)，自由基的大量生成造成嚴(yán)重的氧化損傷。結(jié)合病理組織學(xué)，本研究結(jié)果表明，黃藥子中含有損傷肝細(xì)胞提高XOD活性的化合物，打破了機(jī)體對(duì)自由基生成和消除的平衡，造成肝組織的受損和細(xì)胞毒作用;以1∶2進(jìn)行黃藥子與當(dāng)歸進(jìn)行配伍使用時(shí)，具有顯著降低XOD活性的作用［5］。

［1］ Trowell OA．The establishment and app lication of iso lated perfused rat liver preperation［J］．J Physiol(London)，1942，100:432．

［2］ Miller LL．Biological synthesis of serum protein by the iso lated perfused rat liver［J］．J Exp Med，1951，94:431．

［3］ 丁選勝，李歐．海藻甘草及其相配伍后的水提取物的肝毒性研究［J］．江蘇中醫(yī)藥，2002，23(10):51－54．

［4］ 趙遠(yuǎn)紅，邵鳳珍．黃嘌呤氧化酶與肝病關(guān)系的探討［J］．中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2005，15(3):188－190．

［5］ 于棟華．黃藥子配伍當(dāng)歸的減毒及機(jī)理的研究［D］．哈爾濱:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，2007:27－32．