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        MTT法檢測沒食子酸對兩種細(xì)胞的體外毒性

        2012-12-17 05:30:18嚴(yán)曉鶯陳巨鵬王明艷
        中醫(yī)藥信息 2012年2期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞株抑制率培養(yǎng)液

        嚴(yán)曉鶯,陳巨鵬,王明艷

        (1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇 南京 210046,2.江蘇省中醫(yī)院,江蘇 南京 210029)

        沒食子酸(gallic acid,GA)又名五倍子酸,化學(xué)名3,4,5-三羥基苯甲酸,是一種多酚類化合物,廣泛存在于中草藥山茱萸、五倍子、芍藥[1]及植物葡萄、石榴的果皮中。GA可以抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[2-3],但是對正常細(xì)胞的毒性研究報(bào)道并不多見。本實(shí)驗(yàn)選用MTT實(shí)驗(yàn)檢測GA對體外生長的人正常肝細(xì)胞株LO2和人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖的影響,為其開發(fā)為新藥提供理論依據(jù)。

        1 材料

        1.1 藥品

        沒食子酸(GA,分子量170,中國藥品生物制品檢定所,批號110831-200803);順鉑(DDP,齊魯制藥有限公司,批號0070332DC)。

        1.2 細(xì)胞株

        人正常肝細(xì)胞株 LO2、人肝癌細(xì)胞株 SMMC-7721均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.3 試劑

        RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、小牛血清(NBS)(GIBCO公司);乙二胺四乙酸(EDTA)(SOLARBIO公司);磷酸緩沖鹽(PBS)(博士德公司);溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(AMRESCO公司)。

        1.4 儀器

        圖像獲取系統(tǒng)(OlympusDP71);倒置顯微鏡(MoticAE31);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad680723);超低溫冰箱(MDF-382ECM);CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO);超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);電熱恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);電子分析天平(AY220,日本島津)。

        2 實(shí)驗(yàn)方法

        2.1 藥液的配制

        精確精密稱取沒食子酸17mg,生理鹽水定容至10ml充分溶解,配成濃度為10mmol/L的儲存液,0.22um濾器過濾除菌,-20℃避光保存,臨用前用培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的終濃度。

        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

        復(fù)蘇凍存的細(xì)胞,離心去除凍存液,加入含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(pH值7.2),于37℃飽和濕度、5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)。細(xì)胞生長到80%后,加入 1ml消化液(含 0.02%EDTA,0.25%胰酶)消化,待細(xì)胞變圓,間隙增大時(shí),棄消化液,加入2ml培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液,LO2按1/4比例傳代,SMMC-7721按1/8比例傳代,每3~4天傳1次。

        2.3 MTT 檢測[4]

        分別取對數(shù)生長期的LO2細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞制成密度為5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,每孔100μl接種于96孔板中培養(yǎng)。分為陰性對照組、不同劑量加藥組和陽性對照組,每組設(shè)5個(gè)平行孔,細(xì)胞貼壁以后,棄去舊的培養(yǎng)液,更換新的培養(yǎng)液,加藥組培養(yǎng)液含有 GA,終濃度分別為 6.25、12.5、25、50、100μmol/L,陽性對照組培養(yǎng)液含有順鉑,終濃度為5μg/ml。藥物作用細(xì)胞后 24h、48h、72h,取出培養(yǎng)板,每孔加入 5mg/ml的 MTT 10μl,混勻,繼續(xù)培養(yǎng) 4h,棄去上清液,每孔加入100μl DMSO,震蕩10min使結(jié)晶充分溶解,酶標(biāo)儀測每孔吸光度,波長490nm。抑制率(%)=1-用藥組OD值/陰性對照組OD值×100%。

        2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        使用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        不同劑量的GA作用24h、48h、72h對體外培養(yǎng)的LO2和SMMC-7721細(xì)胞均有一定的抑制作用。

        3.1 GA對LO2細(xì)胞的生長的影響

        6.25 、12.5、25、50、100μmol/L 劑量組與陰性對照組相比有顯著性差異(P<0.05),對LO2細(xì)胞有增殖抑制作用,且呈劑量依賴關(guān)系,25、50、100μmol/L濃度組對LO2細(xì)胞的抑制隨作用時(shí)間的延長而升高,呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系(見表1)。

        表1 沒食子酸作用24、48、72h對LO2細(xì)胞增殖的影響(±s)

        表1 沒食子酸作用24、48、72h對LO2細(xì)胞增殖的影響(±s)

        注:與陰性對照組比較,*P <0.05。

        藥物濃度(μmol/L)與分組24h抑制率(%)48h抑制率(%)72h抑制率(%)陰性對照組0006.25 18.1 ±10.9* 17.4 ±18.5* 17.4 ±9.5*12.5 25.5 ±10.1* 38.6 ±3.7* 36.3 ±9.7*25 42.0 ±10.2* 44.9 ±9.6* 47.8 ±2.9*50 42.5 ±9.7* 47.9 ±8.7* 63.7 ±11.3*100 51.8 ±6.0* 64.9 ±5.1* 77.6 ±5.9*順鉑組(5μg/ml)32.4 ±10.4* 56.8 ±9.1* 79.0 ±4.9*

        3.2 GA對SMMC-7721細(xì)胞的生長的影響

        6.25 、12.5、25、50、100μmol/L 劑量組與陰性對照組相比有顯著性差異(P<0.05),對SMMC-7721細(xì)胞有增殖抑制作用,且呈劑量依賴關(guān)系,各濃度組對細(xì)胞的抑制率隨時(shí)間延長而增高,呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系(見表2)。

        表2 沒食子酸作用24、48、72h對MMC-7721細(xì)胞增殖的影響(±s)

        表2 沒食子酸作用24、48、72h對MMC-7721細(xì)胞增殖的影響(±s)

        注:與陰性對照組比較,*P <0.05。

        藥物濃度(μmol/L)與分組24h抑制率(%)48h抑制率(%)72h抑制率(%)陰性對照組0006.25 16.3 ±9.0* 20.0 ±5.6* 42.2 ±7.0*12.5 22.4 ±10.7* 31.0 ±4.6* 65.7 ±3.1*25 23.1 ±13.7* 49.4 ±2.9* 72.4 ±4.8*50 41.9 ±10.8* 56.1 ±4.5* 82.7 ±1.92*100 44.1 ±8.6* 58.3 ±2.8* 81.8 ±4.2*順鉑組(5μg/ml)18.6 ±8.1* 38.0 ±5.1* 53.5 ±3.2*

        3.3 GA對LO2和SMMC-7721細(xì)胞影響的比較

        由圖1-3可以看出,沒食子酸對LO2和SMMC-7721 都有增殖抑制作用;作用 24h 時(shí),6.25、12.5、25、100μmol/L劑量組對LO2細(xì)胞的抑制高于SMMC-7721,50μmol/L劑量組對兩種細(xì)胞的抑制相仿;作用48h后,25、50μmol/L劑量組對 SMMC-7721細(xì)胞抑制率開始高于對LO2細(xì)胞的抑制;作用72h后,6.25、12.5、25、50μmol/L 劑量組對 SMMC-7721 細(xì)胞的抑制率明顯高于對LO2細(xì)胞的抑制,對二者抑制率的差距增大,但100μmol/L劑量組對LO2細(xì)胞的抑制還是與對SMMC-7721的抑制接近。

        圖1 沒食子酸作用24h對兩種細(xì)胞增殖抑制

        圖2 沒食子酸作用48h對兩種細(xì)胞增殖抑制

        圖3 沒食子酸作用72h對兩種細(xì)胞增殖抑制

        綜上可知,GA對LO2細(xì)胞和AMMC-7721細(xì)胞均有抑制作用;50μmol/L劑量組的GA對LO2的抑制較小,而對SMMC-7721的抑制較大。

        4 討論

        原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢,嚴(yán)重威脅著人類健康和生命。該病發(fā)病早期無特異性表現(xiàn),大部分患者就診時(shí)已處于中晚期階段,現(xiàn)行的常規(guī)的治療手段效果不甚理想。中醫(yī)藥治療肝癌在穩(wěn)定病灶、延長生存時(shí)間、改善生存質(zhì)量等方面發(fā)揮了顯著的療效,不僅單用有效,而且可與手術(shù)、放療、化療聯(lián)合運(yùn)用提高臨床療效和減少毒副反應(yīng)。

        GA作為天然植物中提取的多酚類化合物具有抗氧化、抗自由基作用。然而在金屬離子存在的情況下GA表現(xiàn)為強(qiáng)氧化劑的作用[5],促進(jìn)細(xì)胞 DNA的損傷,誘導(dǎo)其凋亡,而這種損傷是可以被過氧化氫酶阻止[6]。有研究表明,細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶在細(xì)胞中的含量高低決定了對GA的敏感性不同[7],近年來GA的抗腫瘤作用越來越受到人們的重視。

        鑒于絕大多數(shù)的化療藥物對正常細(xì)胞殺傷作用也很大,我們采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測GA對正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用,期望能為尋找有效的減毒增效拮抗劑提供線索。結(jié)果表明,抗腫瘤單體GA對LO2和SMMC-7721細(xì)胞均有一定的毒性,表現(xiàn)為增殖抑制作用,作用早期(24h)對LO2的抑制大于對SMMC-7721的抑制,連續(xù)作用后(48h、72h),對SMMC-7721細(xì)胞的損傷明顯超過對LO2的抑制。綜上所述,在充分發(fā)揮GA抗腫瘤作用的情況下,如何降低其對正常細(xì)胞的影響,需要進(jìn)一步研究。

        [1] 李玉東,刁勇,王立強(qiáng).芍藥及其有效成分抗腫瘤作用的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2009,21(12):27-32.

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