馮 俊 李樹(shù)生 屠恩遠(yuǎn)

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030）

心肌纖維化是高血壓患者對(duì)慢性負(fù)荷增大 （壓力和容量負(fù)荷）的適應(yīng)性反應(yīng)，也是臨床上各種心血管高危事件的危險(xiǎn)因素［1］。心肌纖維化主要表現(xiàn)為膠原纖維的大量沉積，不僅會(huì)影響心功能，而且會(huì)導(dǎo)致心力衰竭［2］。有效的降壓藥在降血壓的同時(shí)，還應(yīng)改善心肌纖維化的癥狀［3］。丹參是目前臨床上具有心血管保護(hù)的藥物，可以逆轉(zhuǎn)心肌纖維化［4］，丹參酮ⅡA是其主要藥效成分，因此推測(cè)丹參是通過(guò)丹參酮ⅡA來(lái)發(fā)揮抗心肌纖維化作用。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）是一種富含半胱氨酸的分泌肽，在心肌纖維化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［5］。本實(shí)驗(yàn)觀察丹參酮ⅡA對(duì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心肌纖維化的影響，檢測(cè)CTGF水平，探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清白蛋白（BSA）（美國(guó)Sigma公司）；胰蛋白酶、Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Gibco公司）；丹參酮ⅡA（西安冠宇生物技術(shù)公司）；青霉素、鏈霉素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、L-谷氨酰胺 （美國(guó)Amresco公司）；BCA蛋白濃度試劑盒、蛋白Marker（北京賽馳生物科技有限公司）；心肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基 （美國(guó)biohermes公司）；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國(guó)Invitrogen公司）；膠片（日本Kodak公司）；RTPCR所需的原料及底物（德國(guó)Qiagen公司）；ECL化學(xué)發(fā)光底物（美國(guó) Thermo Scientific公司）；CTGF、β-actin 的一抗、HRP 標(biāo)記的二抗（美國(guó)SantaCruz公司）；均為分析純（南京化學(xué)試劑公司）。

1.2 儀器 水平層流超凈工作臺(tái) （美國(guó)Thermo Scientific公司）；24孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)Costar公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；光吸收酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）；Light Cyclers熒光PCR擴(kuò)增儀（Roche公司）；5430高速低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；通用型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad）。

1.3 新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng) 培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)［6］。選擇出生24 h內(nèi)的新生大鼠，仰臥位擺放大鼠，采用無(wú)菌操作取出大鼠心室，并進(jìn)行剪碎、消化以及離心處理，采用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并采用差速離心法去除心肌細(xì)胞，將成纖維細(xì)胞接種于專用培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4 Western blot實(shí)驗(yàn)［7］將蛋白樣品與加樣緩沖液混合，煮沸后離心，取上清液進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V、分離膠100 V、半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜20 V）；封閉和洗膜后，加入CTGF一抗孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗孵育，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色處理，并采用Gel-Proanalyzer軟件進(jìn)行條帶的光密度分析，最終結(jié)果以CTGF和β-actin的光密度比值表示。

1.5 RT-PCR 檢測(cè)膠原［8］采用 ΔΔCt法分析 CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ的擴(kuò)增效果，并與β-actin做標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果均以 2-ΔΔCT來(lái)表示。CTGF 的引物為：引物 1（forward）5′-TGACCCC TGCGACCCACA-3′；引物 2（reverse）5′-CAACTGCTTTGGAAGGACTCGC-3′。CollagenI的引物為：引物 1（forward）5′-GAGAGAGCATGACCGATGGATT-3′；引物 2（reverse）5′-GCTACGCTGTTCTTGCAGTGAT-3′。CollagenⅢ的引物為：引物 1（forward）5′-CAGCAGTCCAACGTAGATGAATTG-3′； 引物 2 （reverse）5′-CATGGTTCTGGCTTCCAGACA-3′。β-actin的引物為：引物1（forward）5′-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3′；引物 2（reverse）5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用單因素方差分析比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)心肌成纖維細(xì)胞的影響 AngⅡ（1μmol/L）處理后的心肌成纖維細(xì)胞的Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA水平高于DM SO組，且給予丹參酮ⅡA處理后，Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA水平呈濃度依賴的方式下降，且在50μmol/L濃度下，恢復(fù)正常，見(jiàn)圖1。

圖1 丹參酮ⅡA對(duì)心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響

2.2 丹參酮ⅡA對(duì)心肌成纖維細(xì)胞CTGF的影響 AngⅡ處理后的心肌成纖維細(xì)胞的CTGF和CTGF mRNA水平高于DMSO組，且50 mol/L丹參酮ⅡA可降低CTGF和CTGF mRNA水平，見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 CTGF電泳條帶

圖3 丹參酮ⅡA對(duì)心肌成纖維細(xì)胞CTGF的影響

2.3 外源性的CTGF對(duì)丹參酮ⅡA抗膠原合成作用的影響 給予外源性的CTGF處理后，丹參酮ⅡA抑制心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的作用減弱，且10μmol/L的CTGF可完全減弱丹參酮ⅡA的作用，見(jiàn)圖4。外源性CTGF處理未改變CTGF mRNA水平，見(jiàn)圖5。

圖4 外源性CTGF對(duì)丹參酮ⅡA抗心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的影響

圖5 外源性CTGF對(duì)丹參酮ⅡA處理下CTGF-mRNA的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ處理后，心肌成纖維細(xì)胞的Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA水平高于DMSO組（未處理組），表明AngⅡ處理可導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞的膠原合成增多，而給予丹參酮ⅡA處理可降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA水平，且在50μmol/L的濃度下可使其恢復(fù)正常，表明丹參酮ⅡA對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的心室肌纖維化過(guò)程有一定的保護(hù)作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ處理后，CTGF和CTGF mRNA水平均上升，而丹參酮ⅡA可同樣降低CTGF和CTGF mRNA水平，鑒于CTGF在心肌纖維化中的重要作用，因此推測(cè)丹參酮ⅡA可能是通過(guò)下調(diào)CTGF水平逆轉(zhuǎn)心肌纖維化過(guò)程。通過(guò)給予外源性的CTGF共同處理后發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA抗心肌纖維化的作用減弱，且10μmol/L的CTGF可完全減弱丹參酮ⅡA的作用，同時(shí)對(duì)CTGF mRNA水平?jīng)]有影響，表明丹參酮ⅡA仍可降低內(nèi)源CTGF的轉(zhuǎn)錄，但在外源CTGF存在的情況下，對(duì)纖維化過(guò)程的保護(hù)作用減弱甚至消失，更說(shuō)明了CTGF在丹參酮ⅡA保護(hù)心肌纖維化的重要作用。丹參酮ⅡA下調(diào)CTGF水平的同時(shí)逆轉(zhuǎn)了心肌纖維化的可能原因是降低了TGFβ/smad/CTGF信號(hào)通路的活性，導(dǎo)致下游活動(dòng)受阻，如Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成和沉積［9］。

綜上所述，丹參酮ⅡA具有抗血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心室肌細(xì)胞纖維化的作用，可能的機(jī)制是下調(diào)CTGF水平，這也提示CTGF可作為抗心肌纖維化的重要靶點(diǎn)。

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