李 瑩 劉 洋 張 瑋 邢練軍 宋海燕 李運(yùn)東 王育群

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肝科 (上海，200032) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院

近年來(lái)由于營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、體力活動(dòng)減少、較多高脂肪食物攝入、肥胖、2型糖尿病 (T2DM)、代謝綜合征和久坐行為增加［1～4］，脂肪肝發(fā)病率逐年升高，而其中非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)被認(rèn)為是全球的肝功能異常最常見(jiàn)的原因。在亞洲，非酒精性脂肪性肝病 (NAFLD)的患病率為12%～24%［5］，而在美國(guó)，NAFLD的患病率大約是20% ～30%，NASH為3.5% ～5%［6，7］。自然史研究發(fā)現(xiàn)，肝纖維化和肝硬化的病情惡化只發(fā)生在NASH患者中［8］。細(xì)胞因子與氧化應(yīng)激的相互作用誘導(dǎo)“二次打擊”，在發(fā)展為脂肪性肝炎的過(guò)程中具有舉足輕重的作用［9］。腫瘤壞死因子-α (TNF-α)是一種強(qiáng)效免疫調(diào)節(jié)劑和促進(jìn)炎癥的細(xì)胞因子，參與自身免疫性疾病和傳染病的發(fā)病機(jī)制。TNF-α被證明在脂肪變性中參與干擾胰島素信號(hào)，可能在NASH中具有促進(jìn)炎癥的作用［10］。研究證明兩種不同的飲食結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)TNF受體Ⅰ基因缺陷的小鼠抵抗 NASH［11，12］，而用 TNF-α 抗體治療瘦素缺乏的小鼠可改善肝胰島素抵抗和脂肪肝［13］。并且TNF-α啟動(dòng)子多態(tài)性-308位點(diǎn)罕見(jiàn)的等位基因與自身免疫性疾病和TNF-α的高含量有關(guān)［14］?；诖?，本研究的目的在于分析上海地區(qū)NASH患者TNF-α的不同基因型的特征表現(xiàn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 NASH組共400例，男230例，女170例，年齡 (52.1±14.8)歲，為2009年1月-2011年6月期間就診于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院和曙光醫(yī)院的住院和門(mén)診患者，均依據(jù)病史、臨床癥狀和影像學(xué)等資料確診。體檢為健康人群入對(duì)照組，對(duì)照組50例同期健康體檢者，男27例，女23例，年齡 (48.3±15.2)歲。NASH組與對(duì)照組在性別、年齡、民族等方面的差異均無(wú)顯著性意義。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟病學(xué)會(huì)關(guān)于《非酒精性脂肪性肝病診療指南》中NASH的診斷標(biāo)準(zhǔn)［15］，納入年齡在15～70歲的男性或女性，符合NASH診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者納入觀察組;包括無(wú)飲酒史或飲酒折合乙醇量男性每周＜140 g、女性每周＜70 g;除外病毒性肝炎、藥物性肝病、全胃腸外營(yíng)養(yǎng)、肝豆?fàn)詈俗冃缘瓤蓪?dǎo)致脂肪肝的特定疾病;除原發(fā)疾病臨床表現(xiàn)外，可有乏力、消化不良、肝區(qū)隱痛、肝脾腫大等非特異性癥狀及體征;影像學(xué)的表現(xiàn)符合彌漫性脂肪肝診斷標(biāo)準(zhǔn)，或肝臟組織學(xué)表現(xiàn)符合脂肪性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)等進(jìn)行綜合診斷。

1.3 標(biāo)本采集和基因組DNA提取 研究對(duì)象均抽取外周靜脈血3ml，EDTA.K2抗凝，保存在-20℃冰箱。采用TIANGEN公司 (中國(guó))TIANamp Blood DNA Kit(離心柱型)試劑盒提取基因組DNA?；蚪MDNA保存在-40℃冰箱。

1.4 TNF-α基因型分析

1.4.1 G/A等位基因的序列特異性引物和-308位點(diǎn)PCR產(chǎn)物 采用PCR-RFLP(polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism)法。引物序列參照文獻(xiàn)［16］由上海生工生物技術(shù)公司合成。上游引物為:5'-AGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3';下游引物為:5'-TCCTCCCTGCTCCGATTCCG-3'。PCR擴(kuò)增體系20μl，其中含10×反應(yīng)緩沖液2μl(20mM MgCl2)，dNTPs 0.5μl，引物各 0.4μl，Taq 合酶0.5μl(Fermantas)、模板DNA 50ng。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃3分鐘，變性95℃ 30秒，退火58.5℃ 30秒，延伸72℃ 30秒，循環(huán)30次，最后于72℃ 5分鐘終止反應(yīng)。取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用1μl限制性內(nèi)切酶 NcoⅠ (Fermantas)37℃溫育15分鐘。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠 (含嗅化乙錠)電泳分離，紫外線投射儀檢測(cè)拍照，觀察帶型并進(jìn)行分析。

1.4.2 G/A等位基因的序列特異性引物和-238位點(diǎn)PCR產(chǎn)物 采用PCR-RFLP法。引物序列由 Primer軟件設(shè)計(jì)，經(jīng)上海生工生物技術(shù)公司合成。上游引物為:5'AGAAGACCCCCCTCGGAACC 3';下游引物為:5'CTGGAGGAAGCGGTAGTGGG 3';PCR擴(kuò)增體系20μl，其中含10×反應(yīng)緩沖液2μl(20mM MgCl2)，dNTPs 0.5μl，引物各 0.4μl，Taq 合酶0.5μl(Fermantas)，模板DNA 50ng。反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃3分鐘，變性95℃ 30秒，退火60℃ 30秒，延伸72℃ 30秒，循環(huán)30次，最后于72℃ 5分鐘終止反應(yīng)。取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用1μl限制性內(nèi)切酶 MspⅠ (Fermantas)37℃溫育15分鐘。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠 (含嗅化乙錠)電泳分離，紫外線投射儀檢測(cè)拍照，觀察帶型并進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 基因頻率采用直接計(jì)數(shù)法，兩組間的差異用χ2檢驗(yàn)。按遺傳平衡定律和χ2計(jì)算等位基因頻率，通過(guò)計(jì)算比值比 (OR)，對(duì)NASH與TNF-α各等位基因和基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0軟件包處理。結(jié)果表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，以P≤0.05(雙側(cè)檢驗(yàn))為差異有顯著性意義。分別計(jì)算OR和95%可信區(qū)間 (95%CI)。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α酶切后種基因型 TNF-α酶切后可分為3種基因型，-308、-238位點(diǎn)見(jiàn)圖1、圖2。-308位點(diǎn):G/G型(終產(chǎn)物為87bp，一條帶，G等位基因純合子);G/A型 (終產(chǎn)物為107bp，87bp，兩條帶，雜合子);A/A型 (終產(chǎn)物為107bp，一條帶，A等位基因純合子)。-238位點(diǎn):G/G型(終產(chǎn)物為131bp，一條帶，G等位基因純合子);G/A型(終產(chǎn)物為150bp，131bp，兩條帶，雜合子);A/A型 (終產(chǎn)物為150bp，一條帶，A等位基因純合子)。

圖1 TNF-α啟動(dòng)子-308位點(diǎn)NcoI酶切后產(chǎn)物及分析

圖2 TNF-α啟動(dòng)子-238位點(diǎn)MspI酶切后產(chǎn)物及分析

2.2 TNF-α基因多態(tài)性與NASH的相關(guān)性 TNF-α基因多態(tài)性經(jīng)遺傳平衡Hardy-Weinberg定律檢驗(yàn)，NASH患者和健康對(duì)照者TNF-α基因型及基因頻率分布達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。3種基因型在NASH患者和健康對(duì)照者中的分布情況見(jiàn)表1和表2，

表1 兩組人員TNF-α-308位點(diǎn)多態(tài)性頻率分布［n(%)］

表2 兩組人員TNF-α-238位點(diǎn)多態(tài)性頻率分布［n(%)］

由表1、表2可見(jiàn)，TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域-308多態(tài)性在NASH患者中，G/G型、G/A型和A/A型的基因型頻率分布分別為 226(56.5%)，150(37.5%)和 24(6.0%);TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域-238多態(tài)性，在NASH患者中，G/G型，G/A和A/A型的基因型頻率分布分別為340(85%)，45(11.25%)和15(3.75%)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，NASH患者與TNF-α基因-308位點(diǎn)的基因多態(tài)性存在關(guān)聯(lián)，OR為14.667。

3 討論

目前研究提示，TNF-α基因啟動(dòng)子單核苷酸多態(tài)性影響TNF-α的表達(dá)，并與某些炎癥性疾病或嚴(yán)重的疾病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn)在TNF-α啟動(dòng)子區(qū)域的兩個(gè)位點(diǎn) (-308，-238)發(fā)生鳥(niǎo)嘌呤 (G)到腺嘌呤 (A)的基因突變能影響胰島素抵抗 (IR)和TNF-α在體外的表達(dá)［17］，并與疾病易感性和嚴(yán)重性相關(guān)聯(lián)。有關(guān)NAFLD發(fā)病機(jī)制最廣泛接受的學(xué)說(shuō)是“二次打擊學(xué)說(shuō)”?！暗谝淮未驌簟敝兄|(zhì)在肝細(xì)胞的積累和胰島素抵抗是脂肪肝發(fā)展的主要致病因素，“二次打擊”導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，炎癥和纖維化。抑制“二次打擊”的因素是隨后發(fā)生的的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化，促炎細(xì)胞因子，脂肪因子和線粒體功能障礙［18］。有研究表明，TNF啟動(dòng)子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)可能是與NASH的“二次打擊”相關(guān)［19］。TNF-α是引發(fā)肝損傷的各種細(xì)胞因子之一［20］，這些炎性細(xì)胞因子在損傷肝細(xì)胞的同時(shí)誘導(dǎo)肝纖維化［21，22］。TNF-α可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞類固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1的表達(dá)，肝細(xì)胞脂肪酸合成和甘油三酯的積累［23］。TNF-α可以調(diào)整在肝細(xì)胞內(nèi)毒素介導(dǎo)的解偶聯(lián)蛋白 (UCP-2)mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，敏感性增加，極易發(fā)生炎癥和壞死［24］。在體外研究［14］認(rèn)為，這些多態(tài)性的不同與TNF-α的產(chǎn)量，與疾病的易感性或嚴(yán)重程度，以及其他幾種疾病相關(guān)。也有研究發(fā)現(xiàn)脂肪肝患者TNF-α-238位點(diǎn)基因多態(tài)性突變顯著高于健康對(duì)照組［25］。最近有研究報(bào)道［26］與非洲岡比亞人相比，TNF-α啟動(dòng)子區(qū)域核苷酸-1031，-308，-238位點(diǎn)罕見(jiàn)的等位基因頻率在中國(guó)漢族人群中較低。TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)第-308、-238位點(diǎn)的鳥(niǎo)嘌呤 (G)被腺嘌呤 (A)取代后，原來(lái)可被限制性內(nèi)切酶NcoI，MspI識(shí)別的位點(diǎn)缺失，核苷酸序列不能被切斷，因此產(chǎn)生3種基因型:GG(無(wú)突變)，GA(突變雜合子)，AA(突變純合子)。G存在的等位基因是常見(jiàn)型，稱為T(mén)NF1，是低產(chǎn)量表型，被A取代后的等位基因?qū)偕僖?jiàn)型，稱為T(mén)NF2，是高產(chǎn)量表型。TNF2表型的增多常與一些疾病相關(guān)。不同的肝臟疾病中起主導(dǎo)作用的突變位點(diǎn)也不相同［27］。本研究NASH患者中TNF-α基因-308位點(diǎn)TNF2基因型的分布明顯比健康對(duì)照組增多，而對(duì)于TNF的基因多態(tài)性在NASH發(fā)病中的地位還需要更多的研究。綜上所述，隨著研究的深入，TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性的報(bào)道越來(lái)越多，但研究結(jié)果也不盡相同，本研究通過(guò)了解上海地區(qū)人群中NASH患者TNF-α基因多態(tài)性的分布，將進(jìn)一步為研究我國(guó)漢族人群中TNF-α基因多態(tài)性與相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系提供理論依據(jù)，也將為NASH發(fā)病機(jī)制研究提供資料，有助于我們更深入地理解這些疾病在不同種族、不同地區(qū)間具有的不同的遺傳基因背景的重要意義。

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